Семейство Rho ГТФаз представляет собой семейство небольших (~21 кДа) сигнальных G-белков и является подсемейством суперсемейства Ras . Было показано, что члены семейства Rho ГТФаз регулируют многие аспекты внутриклеточной динамики актина и встречаются во всех эукариотических царствах, включая дрожжи и некоторые растения. Три члена семейства были подробно изучены: Cdc42 , Rac1 и RhoA . Все G-белки являются «молекулярными переключателями», а Rho-белки играют роль в развитии органелл , динамике цитоскелета , движении клеток и других общих клеточных функциях. [1] [2] [3] [4] [5]
Идентификация семейства Rho ГТФаз началась в середине 1980-х годов. Первым идентифицированным членом Rho был RhoA, выделенный по счастливой случайности в 1985 году из скрининга кДНК низкой строгости . [6] Затем, в 1989 году, были идентифицированы Rac1 и Rac2 [7], а затем Cdc42 в 1990 году. [8] Восемь дополнительных членов млекопитающих Rho были идентифицированы в ходе биологических скринингов до конца 1990-х годов, поворотного момента в биологии, когда доступность полных последовательностей генома позволила полностью идентифицировать семейства генов. Все эукариотические клетки содержат Rho ГТФазу (от 6 у дрожжей до 20 у млекопитающих). Таким образом, у млекопитающих семейство Rho состоит из 20 членов, распределенных по 8 подсемействам: Rho, Rnd, RhoD/F, RhoH, Rac, Cdc42, RhoU/V и RhoBTB. [1]
Еще в 1990 году Патерсон и др. начали экспрессировать активированный белок Rho в фибробластах Swiss 3T3 . [9]
К середине 1990-х годов было обнаружено, что белки Rho влияют на формирование клеточных проекций («отростков») в фибробластах. В обзорной статье 1998 года Алан Холл собрал доказательства, показывающие, что не только фибробласты формируют отростки при активации Rho, но и практически все эукариотические клетки. [10]
Обзорная статья Бемента и др. 2006 года исследовала значение пространственных зон активации Rho. [11]
Семейство Rho ГТФаз принадлежит к суперсемейству белков Ras , которое состоит из более чем 150 разновидностей у млекопитающих. Белки Rho иногда обозначают некоторых членов семейства Rho ( RhoA , RhoB и RhoC ), а иногда относятся ко всем членам семейства. Эта статья о семействе в целом. [ необходима цитата ]
У млекопитающих семейство Rho содержит 20 членов. [1] Почти все исследования посвящены трем наиболее распространенным членам семейства Rho: Cdc42, Rac1 и RhoA. [ необходима цитата ]
Эти 20 представителей млекопитающих подразделяются на подсемейство Rac (Rac1, Rac2, Rac3 и RhoG), подсемейство Cdc42 (Cdc42, TC10/RhoQ, TCL/RhoJ), семейство RhoUV (RhoV/Chp и RhoU/Wrch-1/), подсемейство RhoA (RhoA, RhoB и RhoC), подсемейство Rnd (Rnd1/Rho6, Rnd2/RhoN и Rnd3/RhoE), подсемейство RhoD (RhoD и RhoF/Rif), RhoBTB (RhoBTB1&2) и RhoH/TTF. [1]
Были идентифицированы три общих класса регуляторов сигнализации Rho-белка: фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) , белки, активирующие ГТФазу (GAP) , и ингибиторы диссоциации гуаниновых нуклеотидов (GDI) . [12] GEF активируют Rho-белки, катализируя обмен GDP на GTP. GAP контролируют способность GTPase гидролизовать GTP до GDP , контролируя естественную скорость движения от активной конформации к неактивной. Белки GDI образуют большой комплекс с белком Rho, помогая предотвратить диффузию внутри мембраны и в цитозоль и, таким образом, выступая в качестве якоря и обеспечивая жесткий пространственный контроль активации Rho. [12] У человека 82 GEF (71 Dbl-подобный [13] и 11 DOCK-подобных [14] ) положительно контролируют активность членов Rho, в то время как 66 белков GAP контролируют ее отрицательно. [15]
Недавние исследования раскрыли важные дополнительные регуляторные механизмы: микроРНК регулируют посттранскрипционную обработку мРНК, кодирующих Rho GTPase; пальмитоилирование и ядерное нацеливание влияют на внутриклеточное распределение; посттрансляционное фосфорилирование, трансглутамилирование и AMPylation модулируют сигнализацию Rho GTPase; а убиквитинирование контролирует стабильность и оборот белка Rho GTPase. Эти режимы регуляции добавляют сложности к сигнальной сети Rho GTPase и позволяют осуществлять точный пространственно-временной контроль отдельных Rho GTPases. [16]
Каждый белок Rho влияет на многочисленные белки ниже по течению, все из которых играют роль в различных клеточных процессах. Было обнаружено более 60 мишеней трех распространенных Rho ГТФаз. [17] Две молекулы, которые напрямую стимулируют полимеризацию актина, — это белки Arp2/3 и формины, родственные Diaphanous. [18]
Белки Rho/Rac участвуют в широком спектре клеточных функций, таких как полярность клеток, везикулярный транспорт, клеточный цикл и транскриптомная динамика. [2]
Клетки животных образуют множество различных форм в зависимости от их функции и расположения в организме. Белки Rho помогают клеткам регулировать изменения формы на протяжении всего жизненного цикла. Прежде чем клетки смогут пройти ключевые процессы, такие как почкование, митоз или локомоция, они должны иметь некую клеточную полярность . [ необходима цитата ]
Один из примеров роли Rho GTPases в полярности клеток можно увидеть в хорошо изученной дрожжевой клетке. Прежде чем клетка сможет отпочковаться, Cdc42 используется для определения области клеточной мембраны, которая начнет выпячиваться в новую клетку. Когда Cdc42 удаляется из клетки, выросты все еще формируются, но делают это неорганизованным образом. [17]
Одним из наиболее очевидных изменений в морфологии клеток, контролируемых белками Rho, является образование ламеллиподий и филоподий , выступающих отростков, которые выглядят как «пальцы» или «ноги» и часто продвигают клетки или конусы роста по поверхностям. Практически все эукариотические клетки образуют такие отростки при активации Rho. [10] Фибробласты, такие как клетки Swiss 3T3, часто используются для изучения этих явлений.
Многое из того, что известно об изменениях клеточной морфологии и эффектах белков Rho, исходит из создания конститутивно активной мутировавшей формы белка. Мутация ключевой аминокислоты может изменить конформацию всего белка, заставляя его постоянно принимать конформацию, которая напоминает состояние, связанное с ГТФ. [9] Этот белок не может быть инактивирован обычным образом, посредством гидролиза ГТФ, и, таким образом, «застревает». Когда белок Rho, активированный таким образом, экспрессируется в клетках 3T3, возникают морфологические изменения, такие как сокращения и образование филоподий. [9]
Поскольку белки Rho являются G-белками и связаны с плазматической мембраной, их местоположение можно легко контролировать. В каждой ситуации, будь то заживление ран, цитокинез или почкование , место активации Rho можно визуализировать и идентифицировать. Например, если в сферической клетке образовалось круглое отверстие, Cdc42 и другие активные Rho наблюдаются в самой высокой концентрации по окружности круглого повреждения. [11] Одним из методов поддержания пространственных зон активации является прикрепление к актиновому цитоскелету, что не позволяет связанному с мембраной белку диффундировать из области, где он больше всего нужен. [11] Другой метод поддержания заключается в образовании большого комплекса, который устойчив к диффузии и более жестко связан с мембраной, чем сам Rho. [11]
В дополнение к образованию ламеллиподий и филоподий, внутриклеточная концентрация и перекрестные помехи между различными белками Rho управляют расширениями и сокращениями, которые вызывают клеточную локомоцию. Сакумура и др. предложили модель, основанную на дифференциальных уравнениях, которая помогает объяснить активность белков Rho и их связь с движением. Эта модель охватывала три белка Cdc42, RhoA и Rac. Предполагалось, что Cdc42 стимулирует удлинение филоподий и блокирует деполимеризацию актина. Считалось, что RhoA стимулирует ретракцию актина. Rac обрабатывали, чтобы стимулировать удлинение ламеллиподий, но блокировать деполимеризацию актина. Эти три белка, хотя и значительно упрощенные, охватывали ключевые этапы клеточной локомоции. С помощью различных математических методов были найдены решения дифференциальных уравнений, которые описывали различные области активности на основе внутриклеточной активности. В заключение в статье показано, что модель предсказывает, что существует несколько пороговых концентраций, которые вызывают интересные эффекты на активность клетки. Ниже определенной концентрации активность очень мала, что не приводит к расширению рук и ног клетки. Выше определенной концентрации белок Rho вызывает синусоидальные колебания, очень похожие на расширения и сокращения ламеллиподий и филоподий. По сути, эта модель предсказывает, что увеличение внутриклеточной концентрации этих трех ключевых активных белков Rho вызывает несовпадающую по фазе активность клетки, что приводит к расширениям и сокращениям, которые также не совпадают по фазе. [19]
Одним из примеров поведения, которое модулируется белками Rho GTPase, является заживление ран. Раны заживают по-разному у молодых цыплят и взрослых кур. У молодых цыплят раны заживают путем сокращения, подобно тому, как тянут за веревку, чтобы закрыть мешок. У более старых цыплят клетки ползают по ране посредством локомоции. Образование актина, необходимое для закрытия ран у молодых цыплят, контролируется белками Rho GTPase, поскольку после инъекции бактериального экзофермента, используемого для блокирования активности rho и rac, полимеры актина не образуются, и, таким образом, заживление полностью не происходит. [20]
Исследования фибробластов указывают на положительную обратную связь между активностью Cdc42 и оттоком H+ изоформой 1 Na-H-обменника (NHE1) на переднем крае мигрирующих клеток. Отток H+, опосредованный NHE1, необходим для связывания GTP с Cdc42, катализируемого фактором обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), что предполагает механизм регуляции полярности этой небольшой GTPase в мигрирующих клетках. [21]
Другое поведение клеток, на которое влияют белки rho, — это фагоцитоз. Как и большинство других типов модуляции клеточной мембраны, фагоцитоз требует актинового цитоскелета для поглощения других объектов. Актиновые филаменты контролируют формирование фагоцитарной чаши, а активные Rac1 и Cdc42 вовлечены в этот каскад сигнализации. [22]
Еще одним важным аспектом клеточного поведения, который, как полагают, включает сигнализацию rho-белка, является митоз . В то время как активность rho-GTPase в течение многих лет считалась ограниченной полимеризацией актина и, следовательно, цитокинезом , который происходит после митоза, появились новые доказательства, которые показывают некоторую активность в образовании микротрубочек и самом процессе митоза. Эта тема все еще обсуждается, и есть доказательства как за, так и против важности rho в митозе. [23]
Из-за их влияния на подвижность и форму клеток, белки Rho стали четкой целью в изучении конусов роста , которые формируются во время аксональной генерации и регенерации в нервной системе. Белки Rho могут быть потенциальной целью для доставки в повреждения спинного мозга после травматического повреждения. После повреждения спинного мозга внеклеточное пространство становится ингибирующим для естественных усилий, которые нейроны предпринимают для регенерации. [ необходима цитата ]
Эти естественные усилия включают формирование конуса роста на проксимальном конце поврежденного аксона. Вновь образованные конусы роста впоследствии пытаются «проползти» через повреждение. Они чувствительны к химическим сигналам во внеклеточной среде. Одним из многих ингибирующих сигналов являются хондроитинсульфатпротеогликаны (CSPG). Нейроны, растущие в культуре, становятся более способными пересекать области субстрата, покрытые CSPG, после экспрессии конститутивно активного Cdc42 или Rac1 [24] или экспрессии доминантной отрицательной формы (ингибирования) RhoA [ требуется ссылка ] .
Это частично связано с экзогенными белками Rho, управляющими клеточным движением, несмотря на внеклеточные сигналы, способствующие апоптозу и коллапсу конуса роста. Внутриклеточная модуляция белков Rho, таким образом, стала представлять интерес в исследованиях, направленных на регенерацию спинного мозга. [ необходима цитата ]
Дисфункция белков Rho также связана с умственной отсталостью . В некоторых случаях умственная отсталость связана с деформацией дендритных шипиков , которые образуют постсинаптические связи между нейронами . Деформированные дендритные шипики могут быть результатом модуляции сигнализации белка rho. После клонирования различных генов, вовлеченных в умственную отсталость, связанную с Х-хромосомой , были идентифицированы три гена, которые влияют на сигнализацию Rho, включая олигофренин-1 (белок GAP, который стимулирует активность ГТФазы Rac1, Cdc42 и RhoA), PAK3 (участвует в эффектах Rac и Cdc42 на актиновый цитоскелет) и αPIX (GEF, который помогает активировать Rac1 и Cdc42). [25] Из-за влияния Rho-сигнализации на актиновый цитоскелет генетические нарушения белка Rho могут объяснить нерегулярную морфологию нейронных дендритов, наблюдаемую в некоторых случаях умственной отсталости. [ необходима цитата ]
После того, как было обнаружено, что белки Ras мутируют в 30% случаев рака у человека, возникло подозрение, что мутировавшие белки Rho также могут быть вовлечены в воспроизводство рака. [12] Однако по состоянию на август 2007 года онкогенных мутаций в белках Rho обнаружено не было, и только один из них оказался генетически измененным. [12] Чтобы объяснить роль путей Rho без мутации, исследователи теперь обратились за ответами к регуляторам активности rho и уровням экспрессии белков Rho. [ необходима цитата ]
Один из способов объяснить измененную сигнализацию при отсутствии мутации — через повышенную экспрессию. Повышенная экспрессия RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, Rac2, Rac3, RhoE, RhoG, RhoH и Cdc42 была показана при нескольких типах рака. [12] Это повышенное присутствие стольких сигнальных молекул подразумевает, что эти белки способствуют клеточным функциям, которые становятся чрезмерно активными в раковых клетках.
Вторая цель для объяснения роли белков Rho в раке — это их регуляторные белки. Белки Rho очень жестко контролируются широким спектром источников, и было идентифицировано более 60 активаторов и 70 инактиваторов. [17] Было показано, что многочисленные GAP, GDI и GEF подвергаются сверхэкспрессии, подавлению или мутации при различных типах рака. [12] Как только сигнал вверх по течению изменяется, активность его целей вниз по течению, т. е. белков Rho, изменится.
Элленбрук и др. описали ряд различных эффектов активации Rho в раковых клетках. Во-первых, при инициировании опухоли модификация активности Rho может подавлять апоптоз и, следовательно, способствовать искусственному долголетию клеток. После подавления естественного апоптоза можно наблюдать аномальный рост опухоли из-за потери полярности, в которой белки Rho играют неотъемлемую роль. Затем растущая масса может проникать через свои нормальные границы из-за изменения адгезионных белков, потенциально вызванного белками Rho. [12] Наконец, после ингибирования апоптоза, клеточной полярности и адгезионных молекул раковая масса может свободно метастазировать и распространяться в другие области тела.
{{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )Несколько мутаций в белках Rho были выявлены при крупномасштабном секвенировании раковых клеток. Эти мутации перечислены в базе данных Catalogue of Somatic Mutations (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Функциональные последствия этих мутаций неизвестны.
