stringtranslate.com

Генный пистолет

Система доставки частиц PDS-1000/He

В генной инженерии генная пушка или система доставки биолистических частиц — это устройство, используемое для доставки экзогенной ДНК ( трансгенов ), РНК или белка в клетки. Покрывая частицы тяжелого металла интересующим геном и запуская эти микроснаряды в клетки с помощью механической силы, можно внедрить интеграцию желаемой генетической информации в нужные клетки. Технику, связанную с такой доставкой ДНК микроснарядами, часто называют биолистикой , сокращенно от «биологической баллистики». [1] [2]

Это устройство способно трансформировать практически любой тип клеток и не ограничивается трансформацией ядра; он также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии . [3]

Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки можно эффективно использовать на большинстве клеток, но в основном они применяются на растительных клетках.
  1. Генная пушка готова к выстрелу.
  2. Гелий заполняет камеру, и давление на разрывной диск возрастает.
  3. Давление в конечном итоге достигает точки, когда разрывной диск разрывается, и возникающий в результате выброс гелия толкает покрытый ДНК/золотом макроноситель («Пластиковый диск») в стопорный экран.
  4. Когда макроноситель попадает на останавливающий экран, частицы золота, покрытые ДНК, продвигаются через экран в клетки-мишени.

Дизайн генной пушки

Генная пушка изначально представляла собой пневматический пистолет Crosman , модифицированный для стрельбы плотными частицами вольфрама . Он был изобретен Джоном Сэнфордом , Эдом Вольфом и Нельсоном Алленом из Корнелльского университета [4] [5] [6] вместе с Тедом Кляйном из DuPont в период с 1983 по 1986 год. Первоначальной целью был лук (выбранный из-за большого размера клеток). , и устройство использовалось для доставки частиц, покрытых маркерным геном , который передал бы сигнал, если бы произошла правильная вставка транскрипта ДНК. [7] Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдаемой экспрессии маркерного гена в клетках лука.

В самых ранних генных пушках, изготовленных по индивидуальному заказу (изготовленных Нельсоном Алленом), использовался патрон для гвоздестрельного пистолета 22 калибра , чтобы продвигать полиэтиленовый цилиндр (пулю) вниз по стволу Дугласа 22 калибра. Капля вольфрамового порошка, покрытая генетическим материалом, была помещена на пулю и сброшена в чашку Петри внизу. Пуля приваривалась к диску под пластинкой Петри, и генетический материал врезался в образец с эффектом пончика, включающим опустошение в середине образца и кольцо хорошей трансформации по периферии. Пушка была соединена с вакуумным насосом и во время стрельбы находилась под вакуумом. Ранняя конструкция была запущена в ограниченное производство компанией Rumsey-Loomis (местный механический цех на Мекленбург-роуд в Итаке, штат Нью-Йорк, США).

Biolistics, Inc продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелия в качестве невзрывоопасного топлива и многодискового механизма доставки столкновений для минимизации повреждения тканей образца. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро, также используются для доставки генетического материала, причем золото предпочтительнее из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов. [8]

Биолистический дизайн конструкции

Биолистическая трансформация включает интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как конструкция ДНК, в клетки-мишени. Генная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени. [9] [ нужна страница ] Хотя конструкции генов могут различаться по своей конструкции в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию последовательности промотора , последовательности терминатора , интересующего гена и гена-репортера .

Промоутер
Промоторы контролируют расположение и величину экспрессии генов и действуют как «руль и педаль газа» гена. [9] [ нужна страница ] Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены с помощью лабораторного дизайна для точной настройки экспрессии трансгена. Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты является примером широко используемого промотора, который приводит к устойчивой конститутивной экспрессии генов в растениях. [10]
Терминатор
Последовательности терминатора необходимы для правильной экспрессии гена и располагаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Обычным терминатором биолистической трансформации является терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens . Из-за высокой частоты использования этого терминатора в генно-инженерных растениях были разработаны стратегии обнаружения его присутствия в пищевых продуктах для мониторинга несанкционированных ГМ-культур. [11] [ не удалось проверить ]
Репортерный ген
Ген, кодирующий селектируемый маркер, является обычным элементом в конструкциях ДНК и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбранный селектируемый маркер будет зависеть от трансформируемого вида, но обычно это будет ген, обеспечивающий клеткам способность к детоксикации определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин , гигромицин B или глифосат [9] [ нужна страница ] . [12] [13] [14]
Дополнительные элементы
Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как последовательности cre-lox , которые позволяют контролируемое удаление конструкции из целевого генома. [15] Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным интересующим геном.

Приложение

Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Тем не менее, существует большой потенциал использования для людей и других животных.

Растения

Мишенью генной пушки часто является каллус недифференцированных растительных клеток или группа незрелых эмбрионов, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как частицы золота, покрытые ДНК, доставлены в клетки, ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции (временная экспрессия), а иногда она интегрируется в хромосому растения («стабильная» трансформация).

Если доставленная конструкция ДНК содержит селектируемый маркер, то стабильно трансформированные клетки можно отбирать и культивировать с использованием методов культуры тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику или гербициду, то стабильно трансформированные клетки можно отобрать путем включения этого антибиотика или гербицида в среду для культуры ткани.

Трансформированные клетки можно обрабатывать рядом растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины , и каждый из них может делиться и дифференцироваться в организованные, специализированные тканевые клетки целого растения. Эта способность к полной регенерации называется тотипотентностью . Новое растение, возникшее из успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследственные признаки. Использование генной пушки можно противопоставить использованию Agrobacterium tumefaciens и ее Ti-плазмиды для внедрения ДНК в растительные клетки. См. Трансформацию , чтобы узнать о различных методах трансформации у разных видов.

Люди и другие животные

Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцин .

Доставка плазмид в нейроны крыс с помощью генной пушки, в частности в нейроны DRG, также используется в качестве фармакологического предшественника при изучении последствий нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера .

Генная пушка стала распространенным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемых тканях. Помимо возможности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генную пушку можно адаптировать для доставки в клетки широкого спектра жизненно важных красителей. [16]

Бомбардировка генной пушкой также использовалась для трансформации Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекциям . [17]

Преимущества

Биолистика оказалась универсальным методом генетической модификации, и обычно ее предпочитают создавать устойчивые к трансформации культуры, такие как зерновые . Примечательно, что Bt -кукуруза является продуктом биолистики. [9] [ нужна страница ] Трансформация пластид также добилась больших успехов при бомбардировке частицами по сравнению с другими современными методами, такими как трансформация, опосредованная Agrobacterium , которая испытывает трудности с нацеливанием вектора на хлоропласт и его стабильной экспрессией в нем. [9] [ нужна страница ] [18] Кроме того, нет сообщений о том, что хлоропласт подавлял трансген, введенный с помощью генной пушки. [19] Кроме того, всего одним выстрелом из генной пушки опытный специалист может создать два трансформированных организма определенных видов. [18] Эта технология даже позволила модифицировать определенные ткани in situ , хотя это, вероятно, повредит большое количество клеток и трансформирует только некоторые , а не все клетки ткани. [20]

Ограничения

Биолистика случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильный дизайн конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких матриц конструкции ДНК является вполне возможной, что приводит к потенциальным переменным уровням экспрессии и количеству копий вставленного гена. [9] [ нужна страница ] Это связано со способностью конструкций отдавать и забирать генетический материал из других конструкций, в результате чего некоторые не несут трансгена, а другие несут множественные копии; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько их было вставлено. [9] [ нужна страница ] Кроме того, поскольку эукариотические конструкции основаны на незаконной рекомбинации — процессе, посредством которого трансген интегрируется в геном без сходных генетических последовательностей — а не на гомологичной рекомбинации , они не могут быть нацелены на определенные места в геноме, [ 9] [ нужна страница ] за исключением случаев, когда трансген доставляется совместно с реагентами для редактирования генома .

Рекомендации

  1. ^ О'Брайен, Джон А.; Ламмис, Сара CR (2011). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера». БМК Биотехнология . 11:66 . дои : 10.1186/1472-6750-11-66 . ПМК  3144454 . ПМИД  21663596.
  2. ^ Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер (6 марта 2015 г.). «Глава 11 - Стратегии доставки генов». Академическое издательство (Второе изд.). ISBN 978-0-12-800511-8.
  3. ^ Сэнфорд, Джон К. (1990). «Биолистическая трансформация растений». Физиология Плантарум . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  4. ↑ Сегелкен, Роджер (14 мая 1987 г.). «Биолог изобрел пистолет для стрельбы по клеткам ДНК» (PDF) . Корнеллские хроники . п. 3. Архивировано из оригинала (PDF) 29 октября 2013 года . Проверено 5 июня 2014 г.
  5. ^ Сэнфорд, Джей Си; Кляйн, ТМ; Вольф, Эд; Аллен, Н. (1987). «Доставка веществ в клетки и ткани с помощью процесса бомбардировки частиц». Наука и технология твердых частиц . 5 (1): 27–37. дои : 10.1080/02726358708904533.
  6. ^ Кляйн, ТМ; Вольф, Эд; Ву, Р.; Сэнфорд, Джей Си (май 1987 г.). «Высокоскоростные микроснаряды для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки». Природа . 327 (6117): 70–73. Бибкод : 1987Natur.327...70K. дои : 10.1038/327070a0. S2CID  4265777.
  7. ^ Сегелкен, Роджер. «Геновый дробовик». Колледж сельского хозяйства и наук о жизни Корнеллского университета. Архивировано из оригинала 26 апреля 2010 года . Проверено 5 июня 2014 г.
  8. ^ Рассел, Джули А.; Рой, Михир К.; Сэнфорд, Джон К. (1 марта 1992 г.). «Физическая травма и токсичность вольфрама снижают эффективность биолистической трансформации». Физиология растений . 98 (3): 1050–1056. дои : 10.1104/стр.98.3.1050. ISSN  0032-0889. ПМЦ 1080307 . ПМИД  16668726. 
  9. ^ abcdefgh Слейтер, Адриан; Скотт, Найджел; Фаулер, Марк (2008). Биотехнология растений: генетические манипуляции с растениями (2-е изд.). Оксфорд, Нью-Йорк, США: ISBN Oxford University Press Inc. 978-0-19-928261-6.
  10. ^ Бенфей, ПН; Чуа, Н.-Х. (16 ноября 1990 г.). «Промотор 35S вируса мозаики цветной капусты: комбинаторная регуляция транскрипции в растениях». Наука . 250 (4983): 959–966. Бибкод : 1990Sci...250..959B. дои : 10.1126/science.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
  11. ^ «Терминатор нопалинсинтазы: темы Science.gov» . www.science.gov . Проверено 20 ноября 2019 г.
  12. ^ Норрис, Миннесота; Канг, Ю.; Лу, Д.; Уилкокс, бакалавр; Хоанг, Т.Т. (31 июля 2009 г.). «Резистентность к глифосату как новый, совместимый с селективными агентами, не селектируемый к антибиотикам маркер в хромосомном мутагенезе основных генов asd и dapB Burkholderia pseudomallei». Прикладная и экологическая микробиология . 75 (19): 6062–6075. Бибкод : 2009ApEnM..75.6062N. дои : 10.1128/aem.00820-09. ISSN  0099-2240. ПМК 2753064 . ПМИД  19648360. 
  13. ^ Блохлингер, К; Диггельманн, Х. (декабрь 1984 г.). «Гигромицин B-фосфотрансфераза как селектируемый маркер для экспериментов по переносу ДНК с высшими эукариотическими клетками». Молекулярная и клеточная биология . 4 (12): 2929–2931. дои : 10.1128/mcb.4.12.2929. ISSN  0270-7306. ПМК 369308 . ПМИД  6098829. 
  14. ^ Каррер, Хелейн; Хокенберри, Тиш Ноэль; Сваб, Зора; Малига, Пал (октябрь 1993 г.). «Устойчивость к канамицину как селектируемый маркер пластидной трансформации табака». MGG Молекулярная и общая генетика . 241–241 (1–2): 49–56. дои : 10.1007/bf00280200. ISSN  0026-8925. PMID  8232211. S2CID  2291268.
  15. ^ Гилбертсон, Ларри (декабрь 2003 г.). «Рекомбинация Cre-lox: творческие инструменты для биотехнологии растений». Тенденции в биотехнологии . 21 (12): 550–555. doi : 10.1016/j.tibtech.2003.09.011. ISSN  0167-7799. ПМИД  14624864.
  16. ^ Ган, Вэнь-Бяо; Грутцендлер, Хайме; Вонг, Вай Тонг; Вонг, Рэйчел О.Л .; Лихтман, Джефф В. (2000). «Многоцветная «диолистическая» маркировка нервной системы с использованием комбинаций липофильных красителей». Нейрон . 27 (2): 219–25. дои : 10.1016/S0896-6273(00)00031-3 . PMID  10985343. S2CID  16962732.
  17. ^ Прайтис, Вида (2006). «Создание трансгенных линий с использованием методов бомбардировки микрочастицами». К. Элеганс . Методы молекулярной биологии. Том. 351. С. 93–108. дои : 10.1385/1-59745-151-7:93. ISBN 978-1-59745-151-2. ПМИД  16988428.
  18. ↑ Аб Сэнфорд, Джон (28 апреля 2006 г.). «Биолистическая трансформация растений». Физиология Плантарум . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x.
  19. ^ Киккерт, Джули; Видаль, Хосе; Райш, Брюс (2005). «Стабильная трансформация растительных клеток путем бомбардировки частицами/биолистика». Трансгенные растения . Методы молекулярной биологии. Том. 286. стр. 61–78. дои : 10.1385/1-59259-827-7:061. ISBN 978-1-59259-827-4. PMID  15310913. S2CID  44395352.
  20. ^ Хейворд, доктор медицины; Боземарк, НЕТ; Ромагоса, Т. (2012). Селекция растений: основы и перспективы . Springer Science & Business Media. п. 131. ИСБН 9789401115247.

дальнейшее чтение

Внешние ссылки