В молекулярной биологии субклонирование — это метод, используемый для перемещения определенной последовательности ДНК из родительского вектора в целевой вектор .
Субклонирование не следует путать с молекулярным клонированием — родственной технологией.
Ферменты рестрикции используются для вырезания интересующего гена ( вставки ) из родительского. Вставка очищается для того, чтобы изолировать ее от других молекул ДНК. Распространенным методом очистки является изоляция геля . Затем число копий гена амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Одновременно те же самые рестриктазы используются для переваривания (разрезания) назначения. Идея использования тех же самых рестриктаз заключается в создании дополнительных липких концов , которые облегчат лигирование в дальнейшем. Также добавляется фосфатаза , обычно щелочная фосфатаза кишечника теленка (CIAP), для предотвращения самолигирования вектора назначения. Переваренный вектор назначения изолируется/очищается.
Вставка и целевой вектор затем смешиваются с ДНК-лигазой. Типичное молярное соотношение генов вставки и целевых векторов составляет 3:1; [1] при увеличении концентрации вставки самолигирование еще больше уменьшается. После того, как реакционная смесь постоит в течение определенного времени при определенной температуре (в зависимости от размера лигируемых нитей; для получения дополнительной информации см. ДНК-лигаза ), вставка должна успешно включиться в целевую плазмиду .
Плазмида часто трансформируется в бактерию, например E. coli . В идеале, когда бактерия делится, плазмида также должна реплицироваться. В лучшем случае каждая бактериальная клетка должна иметь несколько копий плазмиды. После того, как достаточное количество бактериальных колоний вырастет, их можно минипрепарировать для сбора плазмидной ДНК.
Чтобы обеспечить рост только трансформированных бактерий (которые несут желаемые плазмиды для сбора), в целевом векторе для отбора используется ген-маркер . Типичные гены-маркеры предназначены для устойчивости к антибиотикам или биосинтеза питательных веществ . Так, например, «ген-маркер» может быть для устойчивости к антибиотику ампициллину. Если бы бактерии, которые должны были подхватить желаемую плазмиду, подобрали желаемый ген, то они также содержали бы «ген-маркер». Теперь бактерии, подобравшие плазмиду, могли бы расти в ампициллине, тогда как бактерии, не подобравшие желаемую плазмиду, все равно были бы уязвимы для разрушения ампициллином. Таким образом, успешно трансформированные бактерии были бы «отобраны».
В этом примере ген из библиотеки генов млекопитающих будет субклонирован в бактериальную плазмиду (платформа назначения). Бактериальная плазмида представляет собой фрагмент кольцевой ДНК, содержащий регуляторные элементы, позволяющие бактериям производить генный продукт ( экспрессию гена ), если он помещен в правильное место в плазмиде. Место производства фланкировано двумя сайтами разрезания рестриктазами "A" и "B" с несовместимыми липкими концами.
ДНК млекопитающих не имеет этих сайтов рестрикции, поэтому они встраиваются с помощью ПЦР с перекрытием и расширением . Праймеры разработаны для аккуратного размещения сайтов рестрикции, так что кодирование белка происходит в рамке, и минимум дополнительных аминокислот имплантируется по обе стороны белка.
Продукт ПЦР, содержащий ген млекопитающего с новыми сайтами рестрикции, и плазмида назначения подвергаются рестрикционному расщеплению, а продукты расщепления очищаются с помощью гель-электрофореза .
Продукты переваривания, теперь содержащие совместимые друг с другом липкие концы (но несовместимые сами с собой липкие концы), подвергаются лигированию, в результате чего образуется новая плазмида, содержащая фоновые элементы исходной плазмиды с другой вставкой.
Плазмида трансформируется в бактерии, и идентичность вставки подтверждается секвенированием ДНК .