.jpg/1280px-Line_of_culture_flask_(385575933).jpg)
В биологии субкультура — это либо новая клеточная культура , либо микробиологическая культура , созданная путем переноса некоторых или всех клеток из предыдущей культуры в свежую питательную среду . Это действие называется субкультивированием или пассированием клеток. Субкультивирование используется для продления срока службы и/или увеличения количества клеток или микроорганизмов в культуре. [1]
Клеточные линии и микроорганизмы не могут содержаться в культуре бесконечно из-за постепенного повышения уровня метаболитов , которые могут быть токсичными , истощения питательных веществ, присутствующих в культуральной среде, и увеличения количества клеток или размера популяции из-за роста. После истощения питательных веществ и увеличения уровней токсичных побочных продуктов микроорганизмы в культуре перейдут в стационарную фазу , в которой пролиферация значительно снижается или прекращается (значение плотности клеток выходит на плато). Когда микроорганизмы из этой культуры переносятся в свежую среду, питательные вещества запускают рост микроорганизмов, которые пройдут через лаг-фазу , период медленного роста и адаптации к новой среде, за которым следует логарифмическая фаза , период, когда клетки растут экспоненциально. [1]
Поэтому субкультивирование используется для получения новой культуры с более низкой плотностью клеток, чем исходная культура, свежими питательными веществами и без токсичных метаболитов, что позволяет клеткам продолжать рост без риска гибели клеток. Субкультивирование важно как для пролиферирующих (например, микроорганизм, такой как E. coli ), так и для непролиферирующих (например, терминально дифференцированные лейкоциты ) клеток. Субкультивирование также может использоваться для расчета кривой роста (например, время генерации) [2] и получения микроорганизмов логарифмической фазы для экспериментов (например, бактериальная трансформация). [3]
Обычно субкультивирование происходит из культуры определенного объема в свежую питательную среду такого же объема, что позволяет долгосрочное поддержание клеточной линии. Субкультивирование в больший объем питательной среды используется, когда требуется увеличить количество клеток, например, для использования в промышленном процессе или научном эксперименте.
Часто бывает важно записать приблизительное число делений клеток в культуре, записав число пассажей или субкультур. В случае клеток растительной ткани сомаклональная изменчивость может возникать в течение длительных периодов культивирования. Аналогично в линиях клеток млекопитающих хромосомные аберрации имеют тенденцию к увеличению с течением времени. Для микроорганизмов существует тенденция адаптироваться к условиям культивирования, которые редко в точности соответствуют естественной среде микроорганизма, что может изменить их биологию.
Протокол субкультивирования клеток во многом зависит от свойств используемых клеток.
Многие типы клеток, в частности, многие микроорганизмы, растут в растворе и не прикреплены к поверхности. Эти типы клеток можно субкультивировать, просто взяв небольшой объем родительской культуры и разбавив его в свежей среде роста. Плотность клеток в этих культурах обычно измеряется в клетках на миллилитр для крупных эукариотических клеток или как оптическая плотность для света 600 нм для более мелких клеток, таких как бактерии. Клетки часто будут иметь предпочтительный диапазон плотностей для оптимального роста, и субкультура обычно будет пытаться удерживать клетки в этом диапазоне.
Адгезивные клетки, например, многие клеточные линии млекопитающих, растут прикрепленными к поверхности, такой как дно колбы для культивирования клеток или чашки Петри. Эти типы клеток должны быть отсоединены от поверхности, прежде чем их можно будет субкультивировать. Для адгезивных клеток плотность клеток обычно измеряется с точки зрения конфлюэнтности , процента поверхности роста, покрытой клетками. Клетки часто будут иметь известный диапазон конфлюэнтности для оптимального роста, например, клеточная линия млекопитающих, такая как HeLa, обычно предпочитает конфлюэнтность от 10% до 100%, и субкультура обычно будет пытаться удерживать клетки в этом диапазоне. Для субкультуры клетки могут быть отсоединены одним из нескольких методов, включая обработку трипсином для расщепления белков, ответственных за поверхностное прилипание, хелатирование ионов кальция с помощью ЭДТА , что нарушает некоторые механизмы адгезии белков, или механические методы, такие как многократное промывание или использование клеточного скребка. Затем отсоединенные клетки ресуспендируют в свежей среде роста и дают им снова осесть на их поверхность роста.