Обратная транскриптаза теломеразы (сокращенно TERT или hTERT у людей) является каталитической субъединицей фермента теломеразы , которая вместе с компонентом РНК теломеразы (TERC) составляет важнейшую единицу комплекса теломеразы. [5] [6]
Теломеразы являются частью особой подгруппы РНК-зависимых полимераз. Теломераза удлиняет теломеры в цепях ДНК , тем самым позволяя стареющим клеткам , которые в противном случае стали бы постмитотическими и подверглись апоптозу , превысить предел Хейфлика и стать потенциально бессмертными, как это часто бывает с раковыми клетками. Если говорить конкретно, TERT отвечает за катализ добавления нуклеотидов в последовательности TTAGGG к концам теломер хромосомы . [ 7] Это добавление повторяющихся последовательностей ДНК предотвращает деградацию концов хромосом после нескольких раундов репликации. [8]
Отсутствие hTERT (обычно в результате хромосомной мутации ) связано с расстройством «кошачий крик» . [9] [10]
Теломераза — это рибонуклеопротеиновая полимераза , которая поддерживает концы теломер путем добавления теломерного повтора TTAGGG. Фермент состоит из белкового компонента с активностью обратной транскриптазы , кодируемого этим геном, и РНК- компонента, который служит матрицей для теломерного повтора. Экспрессия теломеразы играет роль в клеточном старении, так как она обычно подавляется в постнатальных соматических клетках , что приводит к прогрессивному укорочению теломер. Исследования на мышах показывают, что теломераза также участвует в хромосомной репарации, так как синтез теломерных повторов de novo может происходить при двухцепочечных разрывах . Были идентифицированы альтернативно сплайсированные варианты, кодирующие различные изоформы обратной транскриптазы теломеразы; полная последовательность некоторых вариантов не была определена. Альтернативный сплайсинг в этом локусе считается одним из механизмов регуляции активности теломеразы. [11]
Ген hTERT, расположенный на хромосоме 5, состоит из 16 экзонов и 15 интронов, охватывающих 35 кб. Основной промотор hTERT включает 330 пар оснований выше сайта начала трансляции (AUG, поскольку это РНК, используя слова «экзоны» и «интроны»), а также 37 пар оснований экзона 2 гена hTERT. [12] [13] [14] Промотор hTERT богат GC и не имеет боксов TATA и CAAT , но содержит много сайтов для нескольких факторов транскрипции, что указывает на высокий уровень регуляции множественными факторами во многих клеточных контекстах. [12] Факторы транскрипции, которые могут активировать hTERT, включают в себя множество онкогенов (генов, вызывающих рак), таких как c-Myc , Sp1 , HIF-1 , AP2 и многие другие, в то время как множество генов, подавляющих рак, таких как p53 , WT1 и Menin , производят факторы, которые подавляют активность hTERT. [14] [15] Другая форма повышения регуляции заключается в деметилировании гистонов, проксимальных к промоторной области, что имитирует низкую плотность триметилированных гистонов, наблюдаемую в эмбриональных стволовых клетках . [16] Это позволяет привлекать гистонацетилтрансферазу (HAT) для раскручивания последовательности, что позволяет транскрипцию гена. [15]
Дефицит теломер часто связан со старением, раком и состояниями врожденного дискератоза (DKC) и кошачьего крика . Между тем, повышенная экспрессия hTERT часто связана с раком и образованием опухолей. [9] [17] [18] [19] Регулирование hTERT чрезвычайно важно для поддержания стволовых и раковых клеток и может использоваться различными способами в области регенеративной медицины .
hTERT часто активируется в клетках, которые быстро делятся, включая как эмбриональные стволовые клетки , так и взрослые стволовые клетки . [18] Он удлиняет теломеры стволовых клеток , что, как следствие, увеличивает продолжительность жизни стволовых клеток, позволяя им делиться неограниченное количество раз без укорочения теломер. Таким образом, он отвечает за самообновляющиеся свойства стволовых клеток. Обнаружено, что теломераза специально нацелена на более короткие теломеры, а не на более длинные, из-за различных регуляторных механизмов внутри клеток, которые снижают сродство теломеразы к более длинным теломерам. Это преимущественное сродство поддерживает баланс внутри клетки, так что теломеры имеют достаточную длину для своей функции и в то же время не способствуют аберрантному удлинению теломер. [20]
Высокая экспрессия hTERT также часто используется как ориентир для состояния плюрипотентности и мультипотентности эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Было обнаружено, что повышенная экспрессия hTERT увековечивает определенные типы клеток, а также придает различные интересные свойства различным стволовым клеткам. [14] [21]
hTERT увековечивает различные нормальные клетки в культуре, тем самым наделяя культуры нестволовых клеток свойствами самообновления стволовых клеток. [14] [22] Существует несколько способов, с помощью которых можно достичь увековечения нестволовых клеток, один из которых — введение hTERT в клетки. Дифференцированные клетки часто экспрессируют hTERC и TP1, белок, связанный с теломеразой, который помогает формировать сборку теломеразы, но не экспрессирует hTERT. Следовательно, hTERT действует как ограничивающий фактор для активности теломеразы в дифференцированных клетках. [14] [23] Однако при сверхэкспрессии hTERT в дифференцированных клетках может образовываться активная теломераза. Этот метод использовался для увековечивания эпителиальных и стромальных клеток простаты, которые обычно трудно культивировать in vitro . Введение hTERT позволяет культивировать эти клетки in vitro и делает их доступными для возможных будущих исследований. Введение hTERT имеет преимущество перед использованием вирусного белка для иммортализации, поскольку оно не предполагает инактивации гена-супрессора опухолей , что может привести к образованию рака. [22]
Повышенная экспрессия hTERT в стволовых клетках изменяет свойства клеток. [21] [24] Повышенная экспрессия hTERT увеличивает свойства стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток человека . Профиль экспрессии мезенхимальных стволовых клеток сходится к эмбриональным стволовым клеткам, что позволяет предположить, что эти клетки могут иметь свойства, подобные свойствам эмбриональных стволовых клеток. Однако было отмечено, что мезенхимальные стволовые клетки подвергаются пониженным уровням спонтанной дифференцировки . [21] Это говорит о том, что способность дифференцировки взрослых стволовых клеток может зависеть от активности теломеразы. Следовательно, повышенная экспрессия hTERT, которая сродни повышению активности теломеразы, может создавать взрослые стволовые клетки с большей способностью к дифференцировке и, следовательно, большей способностью к лечению.
Увеличение активности теломеразы в стволовых клетках дает различные эффекты в зависимости от внутренней природы различных типов стволовых клеток. [18] Следовательно, не все стволовые клетки будут иметь повышенные свойства стволовых клеток. Например, исследования показали, что теломераза может быть повышена в клетках пуповинной крови CD34+ посредством сверхэкспрессии hTERT. Выживаемость этих стволовых клеток была повышена, хотя не было увеличения количества удвоений популяции. [24]
Нарушение регуляции экспрессии теломеразы в соматических клетках может быть связано с онкогенезом . [11]
Исследования ассоциаций по всему геному показывают, что TERT является геном восприимчивости к развитию многих видов рака, [25] включая рак легких. [26]
Активность теломеразы связана с количеством раз, которое может делиться клетка, играя важную роль в бессмертии клеточных линий, таких как раковые клетки . Ферментный комплекс действует посредством добавления теломерных повторов к концам хромосомной ДНК. Это создает бессмертные раковые клетки. [27] Фактически, существует сильная корреляция между активностью теломеразы и злокачественными опухолями или раковыми клеточными линиями. [28] Не все типы рака человека имеют повышенную активность теломеразы. 90% раковых заболеваний характеризуются повышенной активностью теломеразы. [28] Рак легких является наиболее хорошо охарактеризованным типом рака, связанным с теломеразой. [29] В некоторых типах клеток, таких как первичные человеческие фибробласты , которые становятся стареющими примерно после 30–50 удвоений популяции, наблюдается отсутствие существенной активности теломеразы . [28] Также имеются доказательства того, что активность теломеразы увеличивается в тканях, таких как линии зародышевых клеток , которые являются самообновляющимися. С другой стороны, нормальные соматические клетки не обладают обнаруживаемой активностью теломеразы. [30] Поскольку каталитическим компонентом теломеразы является ее обратная транскриптаза hTERT и компонент РНК hTERC, hTERT является важным геном для исследования с точки зрения рака и опухолеобразования .
Ген hTERT был исследован на предмет мутаций и их связи с риском заболевания раком. Было обнаружено более двухсот комбинаций полиморфизмов hTERT и развития рака. [29] Было задействовано несколько различных типов рака, и сила корреляции между полиморфизмом и развитием рака варьировалась от слабой до сильной. [29] Регуляция hTERT также была исследована для определения возможных механизмов активации теломеразы в раковых клетках. Важно отметить, что мутации в промоторе hTERT были впервые обнаружены в меланоме и впоследствии были показаны как наиболее распространенные некодирующие мутации при раке. [31] Гликогенсинтаза киназа 3 ( GSK3 ), по-видимому, сверхэкспрессируется в большинстве раковых клеток. [27] GSK3 участвует в активации промотора, контролируя сеть факторов транскрипции . [27] Лептин также участвует в увеличении экспрессии мРНК hTERT через сигнальный трансдуктор и активацию транскрипции 3 ( STAT3 ), предлагая механизм увеличения заболеваемости раком у людей с ожирением. [27] Существует несколько других регуляторных механизмов, которые изменены или аберрантны в раковых клетках, включая сигнальный путь Ras и другие регуляторы транскрипции. [27] Фосфорилирование также является ключевым процессом посттранскрипционной модификации, который регулирует экспрессию мРНК и клеточную локализацию. [27] Очевидно, что существует множество регуляторных механизмов активации и подавления активности hTERT и теломеразы в клетке, что обеспечивает методы иммортализации в раковых клетках.
Если повышенная активность теломеразы связана со злокачественностью , то возможные методы лечения рака могут включать ингибирование ее каталитического компонента, hTERT, для снижения активности фермента и вызова гибели клеток. Поскольку нормальные соматические клетки не экспрессируют TERT, ингибирование теломеразы в раковых клетках может вызывать старение и апоптоз, не влияя на нормальные человеческие клетки. [27] Было обнаружено, что доминантно-негативные мутанты hTERT могут снижать активность теломеразы внутри клетки. [28] Это приводило к апоптозу и гибели клеток в клетках с короткой длиной теломер , что является многообещающим результатом для лечения рака. [28] Хотя клетки с длинными теломерами не подвергались апоптозу, они развивали смертные характеристики и подвергались укорочению теломер. [28] Также было обнаружено, что активность теломеразы ингибируется фитохимическими веществами, такими как изопреноиды , генистеин , куркумин и т. д. [27] Эти химические вещества играют роль в ингибировании пути mTOR посредством снижения регуляции фосфорилирования. [27] Путь mTOR очень важен в регуляции синтеза белка, и он взаимодействует с теломеразой, увеличивая ее экспрессию. [27] Было обнаружено, что несколько других химических веществ ингибируют активность теломеразы и в настоящее время тестируются в качестве потенциальных вариантов клинического лечения, таких как аналоги нуклеозидов , производные ретиноевой кислоты , хинолоновые антибиотики и производные катехина . [30] Существуют также другие методы ингибирования теломеразы, основанные на молекулярной генетике, такие как антисмысловая терапия и РНК-интерференция . [30]
Было показано, что фрагменты пептида hTERT вызывают цитотоксическую реакцию Т-клеток против теломераза-положительных опухолевых клеток in vitro . [32] Ответ опосредуется дендритными клетками , которые могут отображать антигены, ассоциированные с hTERT, на рецепторах MHC класса I и II после аденовирусной трансдукции плазмиды hTERT в дендритные клетки, которые опосредуют ответы Т-клеток . [33] Затем дендритные клетки способны отображать антигены , ассоциированные с теломераза , даже при неопределяемом количестве теломеразной активности, пока присутствует плазмида hTERT. [34] Иммунотерапия против теломераза-положительных опухолевых клеток является перспективной областью в исследовании рака, которая, как было показано в исследованиях in vitro и на мышиных моделях . [35]
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) — это соматические клетки, которые были перепрограммированы в состояние, подобное стволовым клеткам, путем введения четырех факторов ( Oct3/4 , Sox2 , Klf4 и c-Myc ). [36] iPS-клетки обладают способностью к самообновлению неограниченное время и вносят вклад во все три зародышевых слоя при имплантации в бластоцисту или использовании при формировании тератомы . [36]
Ранняя разработка линий iPS-клеток не была эффективной, так как они давали до 5% соматических клеток, успешно перепрограммированных в состояние, подобное стволовым клеткам. [37] При использовании иммортализованных соматических клеток ( дифференцированных клеток с повышенной регуляцией hTERT ) перепрограммирование iPS-клеток было увеличено в двадцать раз по сравнению с перепрограммированием с использованием смертных клеток. [37]
Реактивация hTERT, а затем и теломеразы , в человеческих iPS-клетках использовалась в качестве показателя плюрипотентности и перепрограммирования в состояние, подобное ES (эмбриональным стволовым клеткам), при использовании смертных клеток. [36] Перепрограммированные клетки, которые не экспрессируют достаточные уровни hTERT, переходят в состояние покоя после ряда репликаций в зависимости от длины теломер, сохраняя при этом способности дифференцироваться, подобные стволовым клеткам. [37] Реактивация активности TERT может быть достигнута с использованием только трех из четырех факторов перепрограммирования, описанных Такахаши и Яманакой: если быть точным, Oct3/4 , Sox2 и Klf4 необходимы, тогда как c-Myc — нет. [16] Однако это исследование было проведено с клетками, содержащими эндогенные уровни c-Myc , которые могли быть достаточными для перепрограммирования.
Длина теломер в здоровых взрослых клетках удлиняется и приобретает эпигенетические характеристики, сходные с характеристиками ES-клеток при перепрограммировании в iPS-клетки. Некоторые эпигенетические характеристики ES-клеток включают низкую плотность триметилированных гистонов H3K9 и H4K20 на теломерах, а также повышенное обнаруживаемое количество транскриптов TERT и активность белка. [16] Без восстановления TERT и связанных с ними белков теломеразы эффективность iPS-клеток была бы резко снижена. iPS-клетки также потеряли бы способность к самообновлению и в конечном итоге состарились бы . [16]
Пациенты с врожденным дискератозом (DKC ) характеризуются дефектным поддержанием теломер , что приводит к проблемам с регенерацией стволовых клеток . [17] iPS-клетки, полученные от пациентов с DKC с гетерозиготной мутацией в гене TERT, демонстрируют 50%-ное снижение активности теломеразы по сравнению с iPS-клетками дикого типа . [38] Наоборот, мутации в гене TERC (РНК-часть комплекса теломеразы) могут быть преодолены путем повышения регуляции за счет перепрограммирования, пока ген hTERT остается неповрежденным и функциональным. [39] Наконец, iPS-клетки, полученные с помощью клеток DKC с мутировавшим геном дискерина (DKC1), не могут собирать комплекс hTERT/РНК и, таким образом, не имеют функциональной теломеразы. [38]
Функциональность и эффективность перепрограммированной iPS-клетки определяется способностью клетки повторно активировать комплекс теломераз и удлинять свои теломеры, обеспечивая самообновление. hTERT является основным ограничивающим компонентом комплекса теломераз, а дефицит неповрежденного hTERT препятствует активности теломеразы, что делает iPS-клетки непригодным путем к терапии расстройств, связанных с дефицитом теломер. [38]
Хотя механизм не полностью изучен, воздействие андрогенов на гемопоэтические клетки с дефицитом TERT привело к повышению уровня активности TERT. [40] Клетки с гетерозиготной мутацией TERT, такие как у пациентов с DKC (врожденный дискератоз) , которые обычно демонстрируют низкие базовые уровни TERT, могут быть восстановлены до нормальных уровней, сопоставимых с контрольными клетками. Уровни мРНК TERT также увеличиваются при воздействии андрогенов. [40] Андрогенная терапия может стать подходящим методом лечения заболеваний системы кровообращения, таких как дегенерация костного мозга и низкий уровень крови, связанный с DKC и другими состояниями с дефицитом теломеразы. [40]
По мере старения организмов и размножения клеток теломеры укорачиваются с каждым раундом репликации. Клетки, ограниченные определенной линией, способны делиться только определенное количество раз, установленное длиной теломер, прежде чем они стареют . [41] Истощение и раскрытие теломер было связано с дегенерацией органов, недостаточностью и фиброзом из-за того, что предшественники становятся неподвижными и неспособными дифференцироваться . [20] [41] Используя in vivo модель мышей с дефицитом TERT , реактивация гена TERT в покоящихся популяциях во многих органах реактивировала теломеразу и восстанавливала способность клеток к дифференциации . [42] Реактивация TERT подавляет сигналы повреждения ДНК, связанные с клеточными митотическими контрольными точками, что позволяет пролиферировать и устранять дегенеративный фенотип . [42] В другом исследовании введение гена TERT здоровым годовалым мышам с использованием сконструированного аденоассоциированного вируса привело к увеличению продолжительности жизни на 24% без какого-либо увеличения заболеваемости раком. [43]
Парадоксально, но генетические варианты в локусе TERT, которые связаны с большей длиной теломеры лейкоцитов, связаны с более быстрыми темпами эпигенетического старения в крови согласно молекулярному биомаркеру старения, известному как эпигенетические часы . [44] Аналогичным образом, экспрессия человеческого TERT не останавливала эпигенетическое старение в человеческих фибробластах. [44]
Ген hTERT стал основным направлением генной терапии рака из-за его экспрессии в опухолевых клетках, но не в соматических взрослых клетках. [45] Одним из методов является предотвращение трансляции мРНК hTERT путем введения siRNA , которые являются дополнительными последовательностями, связывающимися с мРНК, предотвращая процессинг гена после транскрипции . [46] Этот метод не устраняет активность теломеразы , но снижает активность теломеразы и уровни мРНК hTERT, наблюдаемые в цитоплазме . [46] Более высокие показатели успеха были отмечены in vitro при сочетании использования антисмысловых последовательностей hTERT с введением плазмиды , подавляющей опухоль, при аденовирусной инфекции, такой как PTEN . [47]
Другой изученный метод — это манипулирование промотором hTERT для индукции апоптоза в опухолевых клетках. Последовательности плазмидной ДНК могут быть изготовлены с использованием промотора hTERT, за которым следуют гены, кодирующие определенные белки. Белок может быть токсином, апоптотическим фактором или вирусным белком. Токсины, такие как дифтерийный токсин, вмешиваются в клеточные процессы и в конечном итоге вызывают апоптоз. [45] Факторы апоптотической смерти, такие как FADD (Fas-ассоциированный белок с доменом смерти), могут быть использованы для принуждения клеток, экспрессирующих hTERT, к апоптозу. [48] Вирусные белки, такие как вирусная тимидинкиназа, могут быть использованы для специфического нацеливания препарата. [49] Вводя пролекарство, активируемое только вирусным ферментом, можно достичь специфического нацеливания на клетки, экспрессирующие hTERT. [49] При использовании промотора hTERT будут затронуты только клетки, экспрессирующие hTERT, и это позволяет осуществлять специфическое нацеливание на опухолевые клетки. [45] [48] [49]
Помимо терапии рака, ген hTERT использовался для стимуляции роста волосяных фолликулов. [50] Схематическая анимация генной терапии представлена ниже.
Было показано, что обратная транскриптаза теломеразы взаимодействует с: