Профилирование ДНК — это определение профиля ДНК для юридических и следственных целей. Методы анализа ДНК менялись бесчисленное количество раз за прошедшие годы по мере того, как менялись технологии и позволяли получать больше информации с меньшим количеством исходного материала. Современный анализ ДНК основан на статистическом расчете редкости полученного профиля в популяции.
Хотя профилирование ДНК наиболее известно как инструмент судебно-медицинских расследований, оно также может использоваться и для некриминалистических целей, таких как проверка отцовства и генеалогические исследования человека .
Методы создания профиля ДНК были разработаны Алеком Джеффрисом и его командой в 1985 году. Джефферис обнаружил, что неизвестный образец ДНК, такой как кровь, волосы, слюна или сперма, можно проанализировать и разработать уникальный образец/профиль ДНК. [1] Через год после открытия Джеффриса попросили использовать его новый анализ ДНК, чтобы осудить человека, который, по мнению полиции, был ответственен за два убийства изнасилования. Джеффрис доказал невиновность мужчины, используя ДНК с места преступления. [2]
Когда анализ ДНК был впервые открыт, для анализа ДНК использовался процесс, называемый полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ). Однако ПДРФ был неэффективным процессом из-за того, что для него требовалось большое количество ДНК, которую не всегда можно было получить с места преступления. Современные технологии вышли за рамки RFLP. Анализ коротких тандемных повторов (STR) является современным эквивалентом RFLP. STR-анализ не только использует меньше образца для анализа ДНК, но также является частью более крупного процесса, называемого полимеразной цепной реакцией (ПЦР). ПЦР — это процесс, с помощью которого можно быстро воспроизвести до миллиарда копий отдельного сегмента ДНК. [3]
Первым настоящим методом профилирования ДНК стал анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Первое использование RFLP-анализа в судебно-медицинской экспертизе произошло в 1985 году в Соединенном Королевстве. [4] В этом типе анализа использовались тандемные повторы с переменным числом (VNTR), чтобы различать людей. VNTR распространены по всему геному и состоят из одной и той же последовательности ДНК, повторяющейся снова и снова. [5] У разных людей может быть разное количество повторов в определенном месте генома. [4] Например, у человека А может быть 4 повтора, а у человека Б — 5 повторов. Различия были визуализированы с помощью процесса, называемого гель-электрофорезом . Меньшие фрагменты будут проходить через гель дальше, чем более крупные фрагменты, разделяющие их. [6] Эти различия использовались для различения людей, и когда несколько сайтов VNTR работали вместе, RFLP-анализ имел высокую степень индивидуализирующей силы. [7]
Процесс RFLP-анализа был чрезвычайно трудоемким, и из-за длины используемых повторов (от 9 до 100 пар оснований) [5] [8] методы амплификации, такие как полимеразная цепная реакция, не могли быть использованы. Это ограничивало ПДРФ образцами, которые уже изначально имели большее количество доступной ДНК, и не давало хороших результатов с деградированными образцами. [9] ПДРФ-анализ был основным типом анализа, выполняемым в большинстве судебно-медицинских лабораторий, прежде чем он был окончательно выведен из употребления и заменен более новыми методами. В 2000 году ФБР полностью отказалось от него и заменило его анализом STR. [10]
Разработанный в 1991 году [10] альфа-тестирование DQ был первым методом судебно-медицинской экспертизы ДНК, в котором использовалась полимеразная цепная реакция. [11] Этот метод позволил использовать гораздо меньше клеток, чем анализ RFLP, что сделало его более полезным для мест преступлений, где не было большого количества материала ДНК, который требовался ранее. [12] Локус (или местоположение) DQ альфа 1 также был полиморфным и имел множество различных аллелей , которые можно было использовать для ограничения пула людей, которые могли бы дать такой результат, и увеличения вероятности исключения. [13]
Локус DQ-альфа был объединен с другими локусами в коммерчески доступном наборе под названием Polymarker в 1993 году. [14] Polymarker был предшественником современных наборов для мультиплексирования и позволял исследовать несколько различных локусов с помощью одного продукта. Несмотря на то, что Polymarker более чувствителен, чем анализ RFLP, он не обладает такой же дискриминационной силой, как более старый тест RFLP. [14] К 1995 году ученые попытались вернуться к анализу на основе VNTR в сочетании с технологией ПЦР, называемой полиморфизмом длин амплифицированных фрагментов (AmpFLP). [10]
AmpFLP был первой попыткой объединить анализ VNTR с ПЦР для судебно-медицинской экспертизы. В этом методе использовались более короткие VNTR, чем в RFLP-анализе, от 8 до 16 пар оснований. Более короткие пары оснований AmpFLP были разработаны для лучшей работы в процессе амплификации ПЦР. [8] Была надежда, что этот метод позволит использовать избирательную силу RFLP-анализа с возможностью обработки образцов, которые имеют меньше ДНК-матрицы для работы или которые были иным образом деградированы. Однако только несколько локусов были проверены для судебно-медицинских приложений для работы с анализом AmpFLP, поскольку судебно-медицинские лаборатории быстро перешли к другим методам, что ограничило их способность различать судебно-медицинские образцы. [15]
В конечном итоге этот метод так и не получил широкого распространения, хотя он до сих пор используется в небольших странах из-за его более низкой стоимости и более простой настройки по сравнению с новыми методами. [16] [17] К концу 1990-х годов лаборатории начали переходить на более новые методы, включая STR-анализ. В них использовались еще более короткие фрагменты ДНК, и их можно было более надежно амплифицировать с помощью ПЦР, сохраняя при этом и улучшая дискриминирующую силу старых методов. [10]
Анализ коротких тандемных повторов (STR) — это основной тип судебно-медицинского анализа ДНК, выполняемый в современных лабораториях ДНК. STR-анализ основан на RFLP и AmpFLP, использовавшихся в прошлом, за счет сокращения размера повторяющихся единиц до 2–6 пар оснований и за счет объединения нескольких различных локусов в одну реакцию ПЦР. Эти наборы для мультиплексного анализа могут определять значения аллелей для десятков различных локусов по всему геному, одновременно ограничивая количество времени, необходимое для получения полного индивидуализирующего профиля. STR-анализ стал золотым стандартом профилирования ДНК и широко используется в судебно-медицинской экспертизе.
STR-анализ также может быть ограничен только Y-хромосомой . Анализ Y-STR можно использовать в случаях, когда речь идет об отцовстве, или при семейном поиске , поскольку Y-хромосома идентична по отцовской линии (за исключением случаев, когда произошла мутация ). Некоторые наборы для мультиплексирования объединяют в один набор как аутосомные, так и Y-STR локусы, что еще больше сокращает время, необходимое для получения большого объема данных.
В настоящее время для анализа STR требуется несколько клеток для создания полного профиля ДНК. Однако наука приближается к созданию полного профиля ДНК с использованием STR-анализа отдельных клеток. [18]
Секвенирование митохондриальной ДНК — это специализированный метод, в котором используется отдельная митохондриальная ДНК, присутствующая в большинстве клеток. Эта ДНК передается по материнской линии и не уникальна у разных людей. Однако из-за количества митохондрий, присутствующих в клетках, анализ мтДНК можно использовать для сильно деградированных образцов или образцов, где STR-анализ не дает достаточно данных, чтобы быть полезными. мтДНК также присутствует в местах, где аутосомная ДНК отсутствует, например, в стержнях волос.
Из-за повышенной вероятности загрязнения при работе с мтДНК лишь немногие лаборатории обрабатывают образцы митохондрий. Те, у которых есть специальные протоколы, дополнительно отделяют разные образцы друг от друга, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Rapid DNA — это технология «мазка в профиль», которая полностью автоматизирует весь процесс выделения, амплификации и анализа ДНК. Инструменты Rapid DNA позволяют перейти от мазка к профилю ДНК всего за 90 минут и устраняют необходимость в обученных ученых для выполнения этого процесса. Эти инструменты рассматриваются для использования в процессе регистрации правонарушителей, что позволит полицейским получить профиль ДНК арестованного лица.
Недавно в США был принят Закон о быстрой ДНК 2017 года, предписывающий ФБР создать протоколы для внедрения этой технологии по всей стране. В настоящее время ДНК, полученная с помощью этих инструментов, не подлежит загрузке в национальные базы данных ДНК, поскольку они не анализируют достаточно локусов, чтобы соответствовать стандартному порогу. Тем не менее, несколько полицейских агентств уже используют инструменты Rapid DNA для сбора образцов у людей, арестованных в их районе. Эти местные базы данных ДНК не подпадают под действие федеральных постановлений или правил штата.
Массивно-параллельное секвенирование (MPS), также известное как секвенирование следующего поколения, основано на анализе STR путем введения прямого секвенирования локусов. Вместо количества повторов, присутствующих в каждом месте, MPS даст ученому фактическую последовательность пар оснований. Теоретически MPS обладает способностью различать однояйцевых близнецов, поскольку случайные точечные мутации могут быть обнаружены в повторяющихся сегментах, которые не могут быть обнаружены традиционным STR-анализом.
Когда профиль ДНК используется в доказательных целях, предоставляется статистика совпадений, которая объясняет, насколько редок профиль в популяции. В частности, эта статистика представляет собой вероятность того, что человек, случайно выбранный из популяции, будет иметь этот конкретный профиль ДНК. Это не вероятность того, что профиль кому-то «соответствует» . Существует множество различных методов определения этой статистики, и каждый из них используется различными лабораториями в зависимости от их опыта и предпочтений. Однако расчет отношения правдоподобия становится предпочтительным методом по сравнению с двумя другими наиболее часто используемыми методами: случайным человеком, который не исключен, и комбинированной вероятностью включения. Статистика совпадений особенно важна при интерпретации смесей, когда в профиль ДНК вносят более одного вклада. Когда эти статистические данные приводятся в зале суда или в лабораторном отчете, они обычно приводятся для трех наиболее распространенных рас в этом конкретном регионе. Это связано с тем, что частоты аллелей в разных локусах менялись в зависимости от происхождения человека. https://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf. Архивировано 15 августа 2022 г. в Wayback Machine.
Вероятность, полученная с помощью этого метода, представляет собой вероятность того, что человек, случайно выбранный из совокупности, не может быть исключен из анализируемых данных. Этот тип статистики совпадений легко объяснить в зале суда лицам, не имеющим научного образования, но он также теряет значительную различительную силу, поскольку не принимает во внимание генотип подозреваемого. Этот подход обычно используется, когда выборка деградирована или содержит так много участников, что невозможно определить единый профиль. Это также полезно для объяснения непрофессионалам, поскольку метод получения статистики прост. Однако из-за ограниченной способности распознавания RMNE обычно не выполняется, если не может быть использован другой метод. RMNE не рекомендуется использовать в данных, указывающих на наличие смеси.
Комбинированная вероятность включения или исключения рассчитывает вероятность того, что случайный, не связанный родством человек внесет вклад в профиль ДНК или смесь ДНК. В этом методе статистика для каждого отдельного локуса определяется с использованием статистики населения, а затем объединяется для получения общего CPI или CPE. Эти расчеты повторяются для всех доступных локусов со всеми доступными данными, а затем каждое значение умножается, чтобы получить общую совокупную вероятность включения или исключения. Поскольку значения умножаются вместе, с помощью CPI можно получить очень маленькие цифры. CPI или CPE считаются приемлемым статистическим расчетом, когда указывается смесь. https://www.promega.com/-/media/files/resources/conference-proceedings/ishi-15/parentage-and-mixture-statistics-workshop/generalpopulationstats.pdf?la=en
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 14 в vWA = 0,10204.
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 17 в vWA = 0,26276.
Вероятность того, что европеец будет иметь аллель 14 или 17 (P) = 0,10204 + 0,26276 = 0,3648.
Вероятность присутствия любых других аллелей (Q) = 1 - P или 1 - 0,3648 = 0,6352.
Вероятность исключения для vWA = Q 2 + 2Q(1-Q) или 0,6352 2 + 2(0,6352)(1 – 0,6352) = 0,86692096 ≈ 86,69%
Вероятность включения для vWA = 1 – CPE или 1 – .86692096 = .13307904 ≈ 13,31%
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 14 в vWA = 0,10204.
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 15 в vWA = 0,11224.
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 16 при vWA = 0,20153.
Вероятность того, что у европеоида будет аллель 19 в vWA = 0,08418.
Вероятность наличия у европеоида любого из 14, 15, 16 или 19 аллелей (P) = 0,10204 + 0,11224 + 0,20153 + 0,08418 = 0,49999
Вероятность присутствия любых других аллелей (Q) = 1 – P или 1 – 0,49999 = 0,50001.
Вероятность исключения для vWA = Q 2 + 2Q(1-Q) или .50001 2 + 2(.50001)(1 - .50001) = .7500099999 ≈ 75%
Вероятность включения для vWA = 1 – CPE или 1 – .7500099999 = .2499900001 ≈ 25%
Отношения правдоподобия (LR) — это сравнение двух разных вероятностей с целью определить, какая из них более вероятна. Когда речь идет о судебном разбирательстве, LR представляет собой вероятность аргумента обвинения по сравнению с вероятностью аргумента защиты с учетом их исходных предположений. В этом сценарии вероятность обвинения часто равна 1, поскольку предполагается, что обвинение не будет преследовать подозреваемого, если он не будет абсолютно уверен (100%), что перед ним тот самый человек. Отношения правдоподобия становятся все более распространенными в лабораториях из-за их полезности для представления статистики данных, указывающих на нескольких участников, а также их использования в программном обеспечении вероятностного генотипирования, которое предсказывает наиболее вероятные комбинации аллелей на основе набора данных.
Недостатком использования отношений правдоподобия является то, что с их помощью очень сложно понять, как аналитики пришли к конкретному значению, а математические вычисления становятся очень сложными по мере того, как в уравнения вводится больше данных. Чтобы решить эти проблемы в зале суда, некоторые лаборатории установили «вербальную шкалу», которая заменяет фактическое числовое значение отношения правдоподобия.