Эксперимент Лурии-Дельбрюка

Эксперимент 1943 года по скорости мутаций

Две возможности, проверенные в эксперименте Лурии-Дельбрюка. (A) Если мутации вызваны средой, ожидается, что на каждой чашке появится примерно одинаковое количество мутантов. (B) Если мутации возникают спонтанно во время деления клеток до посева, на каждой чашке будет очень разное количество мутантов.

Эксперимент Лурии-Дельбрюка (1943) (также называемый тестом на флуктуацию ) продемонстрировал, что у бактерий генетические мутации возникают в отсутствие селективного давления, а не являются ответом на него. Таким образом, был сделан вывод о том, что теория Дарвина о естественном отборе, действующем на случайные мутации, применима как к бактериям, так и к более сложным организмам. Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1969 года отчасти за эту работу.

Простая модель

Предположим, что одна бактерия помещена в питательную среду с богатыми питательными веществами и растет в течение времени ее удвоения, мы получим потомство. Затем мы вводим вызов бактериофагами. Это убьет большинство бактерий, но оставит некоторые в живых. Затем мы можем размазать питательную среду по новой питательной среде и подсчитать количество колоний как количество выживших. ${\displaystyle N\times }$ ${\displaystyle 2^{N}}$

В сценарии Ламарка каждая бактерия сталкивается с вызовом в одиночку. Большинство погибнет, но некоторые переживут испытание и найдут новую колонию. В сценарии Дарвина устойчивость к фагу будет случайным образом возникать во время репликации. Те, кто унаследовал устойчивость, выживут, а те, кто не унаследовал, умрут.

В ламарковском сценарии, если предположить, что каждая бактерия имеет одинаково малую вероятность выживания, то число новых колоний распределено по закону Пуассона, которое экспоненциально убывает при большом числе выживших.

В дарвиновском сценарии, предполагая, что вероятность мутации достаточно мала, чтобы мы ожидали только одну мутацию в течение всей фазы репликации, и что, для простоты, мы действительно получаем только одну мутацию, то с вероятностью выживет один экземпляр, с вероятностью выживут два экземпляра и т. д. То есть вероятность масштабируется как . ${\displaystyle 1/2}$ ${\displaystyle 1/4}$ ${\displaystyle {\frac {1}{\text{number of survivors}}}}$

В частности, если распределение числа выживших оказывается распадающимся скорее по степенному закону, чем по экспоненциальному, то мы можем с высокой статистической вероятностью заключить, что дарвиновский сценарий верен. Это грубый обзор эксперимента Лурии-Дельбрюка. (Раздел 4.4 ^[1] )

История

К 1940-м годам идеи наследования и мутации были общепринятыми, хотя роль ДНК как наследственного материала еще не была установлена. Считалось, что бактерии чем-то отличаются и могут развивать наследственные генетические мутации в зависимости от обстоятельств, в которых они оказываются: короче говоря, была ли мутация у бактерий преадаптивной (предсуществующей) или постадаптивной (направленной адаптацией)? ^[2]

В своем эксперименте Лурия и Дельбрюк инокулировали небольшое количество бактерий ( Escherichia coli ) в отдельные культуральные пробирки. После периода роста они высевали равные объемы этих отдельных культур на агар, содержащий фаг T1 (вирус). Если устойчивость бактерий к вирусу была вызвана индуцированной активацией бактерий, т. е. если устойчивость не была обусловлена ​​наследственными генетическими компонентами, то каждая чашка должна содержать примерно одинаковое количество устойчивых колоний. Предполагая постоянную скорость мутации, Лурия выдвинул гипотезу, что если мутации происходили после и в ответ на воздействие селективного агента, то число выживших будет распределено в соответствии с распределением Пуассона со средним значением , равным дисперсии . Это было не то, что обнаружили Дельбрюк и Лурия: вместо этого число устойчивых колоний на каждой чашке резко различалось: дисперсия была значительно больше среднего.

Лурия и Дельбрюк предположили, что эти результаты можно объяснить возникновением постоянной скорости случайных мутаций в каждом поколении бактерий, растущих в исходных культуральных пробирках. На основе этих предположений Дельбрюк вывел распределение вероятностей (теперь называемое распределением Лурии–Дельбрюка ^{[3] [4]} ), которое дает соотношение между моментами, согласующееся с экспериментально полученными значениями. Поэтому был сделан вывод, что мутации у бактерий, как и у других организмов, являются случайными, а не направленными. ^[5]

Результаты Лурии и Дельбрюка были подтверждены Ньюкомбом более графически, но менее количественно. Ньюкомб инкубировал бактерии в чашке Петри в течение нескольких часов, затем высевал их реплику на две новые чашки Петри, обработанные фагом. Первая чашка оставалась нераспределённой, а вторая чашка затем распластывалась, то есть бактериальные клетки перемещались, позволяя отдельным клеткам в некоторой колонии образовывать свои собственные новые колонии. Если колонии содержали устойчивые бактериальные клетки до вступления в контакт с вирусом-фагом, можно было бы ожидать, что некоторые из этих клеток сформируют новые устойчивые колонии на повторно распластанной чашке и, таким образом, обнаружат большее количество выживших бактерий. Когда обе чашки инкубировались для роста, на повторно распластанной чашке фактически было в 50 раз больше бактериальных колоний. Это показало, что бактериальные мутации в устойчивость к вирусу произошли случайным образом во время первой инкубации. И снова мутации произошли до применения отбора. ^[6]

Совсем недавно результаты Лурии и Дельбрюка были подвергнуты сомнению Кэрнсом и другими, которые изучали мутации в метаболизме сахара как форму экологического стресса. ^[7] Некоторые ученые предполагают, что этот результат мог быть вызван отбором на амплификацию генов и/или более высокой частотой мутаций в клетках, неспособных делиться. ^[8] Другие защитили исследование и предложили механизмы, которые объясняют наблюдаемые явления, соответствующие адаптивному мутагенезу . ^[9]

Это распределение, по-видимому, впервые было определено Холдейном . ^[10] Неопубликованная рукопись была обнаружена в 1991 году в Лондонском университетском колледже, описывающая это распределение. Вывод отличается, но результаты трудно вычислить без использования компьютера.

Описание теста

Небольшое количество клеток используется для инокуляции параллельных культур в неселективной среде. ^[11] Культуры выращиваются до насыщения, чтобы получить одинаковую плотность клеток. Клетки высеваются на селективную среду, чтобы получить количество мутантов ( r ). Разведения высеваются на богатую среду, чтобы рассчитать общее количество жизнеспособных клеток ( Nt ). Количество мутантов, которые появляются в насыщенной культуре, является мерой как скорости мутаций, так и времени возникновения мутантов во время роста культуры: мутанты, появляющиеся на ранних стадиях роста культуры, будут распространять гораздо больше мутантов, чем те, которые возникают позже во время роста. Эти факторы приводят к тому, что частота ( _{r /} Nt ) сильно варьируется, даже если количество мутационных событий ( m ) одинаково. Частота не является достаточно точной мерой мутации, и скорость мутаций ( _m / Nt ) всегда следует рассчитывать.

Оценка скорости мутации (μ) сложна. Лурия и Дельбрюк оценили этот параметр по среднему значению распределения, но впоследствии было показано, что эта оценка смещена.

Метод медианы Ли-Коулсона был введен в 1949 году. ^[12] Этот метод основан на уравнении

${\displaystyle {\frac {r}{m}}-\ln(m)-1.24=0.}$

Где:

r = среднее число колоний на одной чашке, содержащей индикатор (например, рифампицин, хлорат натрия, стрептомицин)

m = переменная, которая будет варьироваться, соответствует мутациям/культуре

Значение переменной m корректируется до тех пор, пока общее значение уравнения не станет близким к 0. Затем скорость мутации (вероятность мутации/клетки/деления или поколения) можно рассчитать по одной из трех формул:

(1) ${\displaystyle \mu =m/median(N_{t})}$

(2) ${\displaystyle \mu =m/(2*median(N_{t}))}$

(3) ${\displaystyle \mu =m*ln(2)/median(N_{t})}$

где N _t — медиана числа жизнеспособных клеток на неиндикаторной пластине (часто LB-агар без добавок)

Выбор формулы для использования зависит от того, на какой стадии деления клетки ожидаются мутации. ^[13]

Этот метод с тех пор был улучшен, но эти более точные методы сложны. Оценка максимального правдоподобия Ма-Сандри-Саркара в настоящее время является наиболее известной оценкой . ^[14] Было описано несколько дополнительных методов и оценок из экспериментальных данных. ^[15]

Два веб-приложения для расчета скорости мутации находятся в свободном доступе: Falcor ^[11] и bz-rates. Bz-rates реализует обобщенную версию оценки максимального правдоподобия Ма-Сандри-Саркара , которая может учитывать относительную дифференциальную скорость роста между мутантными и дикими клетками, а также оценку производящей функции, которая может оценивать как скорость мутации, так и дифференциальную скорость роста. Рабочий пример показан в этой статье Джонса и др . ^[16]

Распределение

Во всех этих моделях предполагалось, что скорость мутации ( μ ) и скорость роста ( β ) постоянны. Модель можно легко обобщить, чтобы ослабить эти и другие ограничения. ^[17] Эти скорости, вероятно, будут отличаться в неэкспериментальных условиях. Модели также требуют, чтобы N _t μ >> 1, где N _t — общее количество организмов. Это предположение, вероятно, будет выполняться в большинстве реалистичных или экспериментальных условий.

Лурия и Дельбрюк ^[5] оценили частоту мутаций (мутации на бактерию в единицу времени) по уравнению

${\displaystyle \mu ={\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}}$

где β — скорость роста клеток, n ₀ — начальное количество бактерий в каждой культуре, t — время, а

${\displaystyle \rho ={\frac {N_{s}}{N}}}$

где N _s — количество культур без резистентных бактерий, а N — общее количество культур.

Модель Ли и Коулсона ^[12] отличалась от оригинала тем, что они рассматривали набор независимых процессов Юла (фильтрованный процесс Пуассона ). Численные сравнения этих двух моделей с реалистичными значениями параметров показали, что они отличаются лишь незначительно. ^[18] Производящая функция для этой модели была найдена Бартлеттом в 1978 году ^[19] и имеет вид

${\displaystyle G(z,\mu ,\phi )=\exp \left({\frac {\mu }{\phi }}\left({\frac {1}{z}}-1\right)\log \left(1-\phi z\right)\right)}$

где μ — скорость мутаций (предполагается постоянной), φ = 1 − e ^{− βt} , где β — скорость роста клеток (также предполагается постоянной), а t — время.

Определение μ из этого уравнения оказалось сложным, но решение было найдено в 2005 году ^{[ требуется ссылка ]} . Дифференцирование производящей функции по μ позволяет применить метод Ньютона-Рафсона , который вместе с использованием функции оценки позволяет получить доверительные интервалы для  μ .

Молекулярная биология

Механизм устойчивости к фагу T1, по-видимому, был обусловлен мутациями в гене fhu A — мембранном белке, который действует как рецептор T1. ^[20] Продукт гена ton B также необходим для заражения T1. Белок FhuA активно участвует в транспорте феррихрома , альбомицина и рифамицина . ^[21] Он также обеспечивает чувствительность к микроцину J25 и колицину M и действует как рецептор для фагов T5 и phi80, а также T1.

Белок FhuA имеет домен бета-бочки (остатки 161–714), который закрыт доменом глобулярной пробки (остатки 1–160). ^[22] Внутри домена пробки находится область связывания TonB (остатки 7–11). Большие мембранные мономерные домены β-бочки имеют 22 β-нити переменной длины, некоторые из которых значительно выходят за пределы гидрофобного ядра мембраны во внеклеточное пространство. Существует 11 внеклеточных петель, пронумерованных от L1 до L11. Петля L4 находится там, где связывается фаг T1.

Ссылки

1. Нельсон, Филип Чарльз; Бромберг, Сарина; Хермундстад, Энн; Прентис, Джейсон (2015). Физические модели живых систем. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: WH Freeman & Company, издательство Macmillan Education. ISBN 978-1-4641-4029-7. OCLC  891121698.
2. Лурия С.Э. (1984) Игровой автомат, сломанная пробирка: Автобиография. Harper & Row
3. Чжэн, Цюй (1999). «Прогресс полувека в изучении распределения Лурия–Дельбрюка». Mathematical Biosciences . 162 (1–2): 1–32. doi :10.1016/S0025-5564(99)00045-0. PMID  10616278.
4. Чжэн, Ц. (2010). «Распределение Лурии-Дельбрюка: ранние статистические размышления об эволюции». Chance . 23 : 15–18. doi :10.1007/s00144-010-0017-y.
5. Luria, SE; Delbrück, M. (1943). «Мутации бактерий от чувствительности к вирусам до устойчивости к вирусам». Genetics . 28 (6): 491–511. doi :10.1093/genetics/28.6.491. PMC 1209226 . PMID  17247100. 
6. Newcombe, HB (1949). «Происхождение бактериальных вариантов». Nature . 164 (4160): 150–151. Bibcode :1949Natur.164..150N. doi :10.1038/164150a0. PMID  18146850. S2CID  4119793.
7. Кэрнс, Дж.; Овербо, Дж.; Миллер, С. (1988). «Происхождение мутантов». Nature . 335 (6186): 142–145. Bibcode :1988Natur.335..142C. doi :10.1038/335142a0. PMID  3045565. S2CID  4304995.
8. Slechta, ES; Liu, J.; Andersson, DI; Roth, JR (2002). «Доказательства того, что выбранная амплификация бактериального аллеля сдвига рамки считывания lac стимулирует реверсию Lac(+) (адаптивную мутацию) с общей гипермутабельностью или без нее». Genetics . 161 (3): 945–956. doi :10.1093/genetics/161.3.945. PMC 1462195 . PMID  12136002. 
9. Фостер, Патрисия Л. (2004). «Адаптивная мутация в Escherichia coli». Журнал бактериологии . 186 (15): 4846–4852. doi :10.1128/jb.186.15.4846-4852.2004. PMC 451643. PMID  15262917 . 
10. Саркар, С (1991). «Решение Холдейна распределения Лурия-Дельбрюка». Генетика . 127 (2): 257–261. doi :10.1093/genetics/127.2.257. PMC 1204353. PMID  2004702 . 
11. Hall, BM; Ma, CX; Liang, P; Singh, KK (2009). "Fluctuation analysis CalculatOR: веб-инструмент для определения скорости мутаций с использованием анализа флуктуации Лурии-Дельбрюка". Биоинформатика . 25 (12): 1564–1565. doi :10.1093/bioinformatics/btp253. PMC 2687991. PMID  19369502 . 
12. Lea, DE; Coulson, CA (1949). «Распределение числа мутантов в бактериальных популяциях». J Genet . 49 (3): 264–285. doi :10.1007/bf02986080. PMID  24536673. S2CID  30301620.
13. Фостер, Патрисия Л. (2006), «Методы определения частоты спонтанных мутаций», Репарация ДНК, часть B , Методы в энзимологии, т. 409, Elsevier, стр. 195–213, doi :10.1016/s0076-6879(05)09012-9, ISBN 978-0-12-182814-1, PMC  2041832 , PMID  16793403
14. Чжэн, Q (2000). «Статистические и алгоритмические методы анализа флуктуаций с SALVADOR в качестве реализации». Math Biosci . 176 (2): 237–252. doi :10.1016/S0025-5564(02)00087-1. PMID  11916511.
15. Роше, WA; Фостер, PL (2000). «Определение скорости мутаций в бактериальных популяциях». Методы . 20 (1): 4–17. doi :10.1006/meth.1999.0901. PMC 2932672. PMID  10610800 . 
16. Джонс, ME; Томас, SM; Роджерс, A (1994). «Эксперименты Лурия-Дельбрука: дизайн и анализ». Генетика . 136 (3): 1209–1216. doi : 10.1093/genetics/136.3.1209 . PMC 1205875. PMID  8005425 . 
17. Houchmandzadeh, B. (2015). "Общая формулировка распределения Лурия-Дельбрюка для числа мутантов". Phys. Rev. E. 92 ( 1): 012719. arXiv : 1505.06108 . Bibcode : 2015PhRvE..92a2719H. doi : 10.1103/PhysRevE.92.012719. PMID  26274214. S2CID  4834465.
18. Чжэн, Q (1999). «Прогресс полувека в изучении распределения Лурия–Дельбрюка». Mathematical Biosciences . 162 (1–2): 1–32. doi :10.1016/s0025-5564(99)00045-0. PMID  10616278.
19. Бартлетт М. (1978) Введение в стохастические процессы. Cambridge University Press, Кембридж, 3-е издание
20. Карвахаль-Родригес, А. (2012). «Обучение тесту флуктуации in silico с использованием mutate: программа для различения гипотез адаптивной и спонтанной мутации». Биохимия и образование в области молекулярной биологии . 40 (4): 277–283. doi : 10.1002/bmb.20615 . PMID  22807434. S2CID  22732741.
21. Эндрисс, Ф.; Браун, М.; Киллманн, Х.; Браун, В. (2003). «Анализ мутантов белка FhuA Escherichia coli выявляет участки активности FhuA». J Bacteriol . 185 (16): 4683–4692. doi :10.1128/jb.185.16.4683-4692.2003. PMC 166461. PMID  12896986 . 
22. Killmann, H; Braun, M; Herrmann, C; Braun, V (2001). «Бочкообразные гибриды FhuA являются активными транспортерами и рецепторами». J Bacteriol . 183 (11): 3476–3487. doi : 10.1128/jb.183.11.3476-3487.2001. PMC 99646. PMID  11344156. 

Внешние ссылки

• В лаборатории мутаций
• Профили в науке: Статьи Сальвадора Э. Лурии Информация о Сальвадоре Лурии из Национальной медицинской библиотеки