Анализ бицинхониновой кислоты ( анализ BCA ), также известный как анализ Смита , в честь его изобретателя Пола К. Смита из Pierce Chemical Company , [1] теперь часть Thermo Fisher Scientific, представляет собой биохимический анализ для определения общей концентрации белка в растворе (от 0,5 мкг/мл до 1,5 мг/мл), аналогичный анализу белка Лоури , анализу белка Брэдфорда или биуретовому реагенту . Общая концентрация белка отображается изменением цвета раствора образца с синего на фиолетовый пропорционально концентрации белка, которую затем можно измерить с помощью колориметрических методов. Анализ BCA был запатентован Pierce Chemical Company в 1989 году, и срок действия патента истек в 2006 году. [2]
Стандартный раствор BCA содержит следующие ингредиенты в сильнощелочном растворе с pH 11,25: бицинхониновую кислоту , карбонат натрия , бикарбонат натрия , тартрат натрия и пентагидрат сульфата меди (II) .
Анализ BCA в первую очередь основан на двух реакциях. Во-первых, пептидные связи в белке восстанавливают ионы Cu 2+ из сульфата меди (II) до Cu 1+ (реакция, зависящая от температуры). Количество восстановленного Cu 2+ пропорционально количеству белка, присутствующего в растворе. Затем две молекулы бицинхониновой кислоты хелатируют с каждым ионом Cu 1+ , образуя комплекс фиолетового цвета, который сильно поглощает свет на длине волны 562 нм .
На комплекс бицинхониновой кислоты Cu 1+ в образцах белка влияет присутствие боковых цепей цистеина/цистина, тирозина и триптофана. При более высоких температурах (от 37 до 60 °C) пептидные связи способствуют образованию реакционного комплекса. Инкубация анализа BCA при более высоких температурах рекомендуется как способ повышения чувствительности анализа при минимизации отклонений, вызванных неравным аминокислотным составом. [3]
Количество белка, присутствующего в растворе, можно определить количественно, измерив спектры поглощения и сравнив с растворами белка известной концентрации.
Анализ BCA в значительной степени несовместим с восстановителями и хелаторами металлов, хотя следовые количества могут допускаться. [4] Сообщается также, что анализ BCA реагирует на обычные мембранные липиды и фосфолипиды. [5]
Существует несколько альтернативных вариантов анализа BCA:
Как описывает Смит, [1] оригинальный анализ BCA представляет собой двухкомпонентный протокол. Два реагента «стабильны неограниченно долго при комнатной температуре». [1] Современные (вероятно, точные или очень похожие) формулы доступны по крайней мере от двух коммерческих поставщиков. [6] [7] Рабочий раствор BCA получается путем смешивания реагента A и реагента B в соотношении 50:1 и может готовиться либо еженедельно (он умеренно стабилен), либо по мере необходимости.
Реагент А [1]
Предложенная, но непроверенная альтернативная формула в рукописи Смита заключается в том, чтобы исключить NaOH (и, предположительно, не выполнять ручную регулировку pH до 11,25), а вместо этого растворить другие компоненты в заранее приготовленном буфере 0,25 М Na2CO3 и 0,01 М NaHCO3 . [ 1 ]
Примечательно, что Смит синтезировал свой собственный BCA посредством реакции Пфитцингера изатина и ацетоина , заменив KOH на NaOH, но в остальном следуя синтетическому методу Лесена и Хенце, [8] поскольку BCA, доступный у коммерческих поставщиков того времени, был слишком загрязнен для их использования. Для достаточной очистки для анализа требовалось не менее трех последовательных перекристаллизаций их синтезированного BCA из воды с температурой 70˚C. [1]
Реагент Б [1]
Анализ BCA Micro BCA представляет собой 3-компонентный протокол, который использует концентрированные запасы биуретовой реакции , BCA и реагентов меди (II) . Он позволяет повысить чувствительность примерно до 2–40 мкг/мл по сравнению с 20–2000 мкг/мл исходного анализа BCA. Однако он имеет другую, и, в общем, более чувствительную, интерференцию небелковых компонентов. [4] Наборы для анализа Micro BCA доступны по крайней мере у двух коммерческих поставщиков. [9] [10] Примечательно, что состав и использование «реагента и протокола Micro BCA» были описаны в оригинальной рукописи Смита, [1] и современные наборы, вероятно, состоят из точной или очень похожей формулы. Протокол состоит из смешивания микрореагента B и раствора меди 25:1 для образования микрореагента C (MC), который не является стабильным при хранении и должен быть свежеприготовленным, а затем смешивания MC 1:1 с микрореагентом A для получения конечного (также нестабильного) рабочего раствора для анализа. Микрореагент A, микрореагент B и раствор меди стабильны неограниченно долго при комнатной температуре. [1]
Микрореагент А (МА) [1]
Микрореагент B (MB) [1]
Раствор меди [1]
Этот тип анализа BCA включает в себя запатентованный тиоловый ковалентный блокирующий «реагент совместимости» [11], также известный как агент совместимости с восстанавливающими агентами (RACA). [12] Хотя это обеспечивает большую совместимость с восстанавливающими агентами, анализ имеет другой профиль интерференции по сравнению с другими небелковыми компонентами. [4]
Этот тип анализа BCA, по-видимому, доступен только от Thermo Fisher Scientific . Сообщается, что он использует «тот же метод восстановления меди, что и традиционный анализ белка BCA с уникальным [запатентованным] хелатором меди», который поглощает при 480 нм вместо 562 нм. [13] Этот запатентованный хелатор и предполагаемая оптимизированная формула реакции биурета позволяют анализу обеспечивать быстрые (<5 мин) результаты без инкубации при 37˚C+ оригинального анализа BCA. Однако анализ имеет другой профиль интерференции от других небелковых компонентов. [4] Количественный колориметрический пептидный анализ Pierce (теперь принадлежащий и доступный от Thermo Fisher Scientific), по-видимому, использует аналогичный или идентичный поглощающий 480 нм запатентованный хелатор меди. [14]