Тест на нуклеиновую кислоту ( NAT ) — это метод, используемый для обнаружения определенной последовательности нуклеиновой кислоты и, таким образом, обычно для обнаружения и идентификации определенного вида или подвида организма, часто вируса или бактерии , которая действует как патоген в крови , ткани , моче и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетические материалы ( РНК или ДНК ), а не антигены или антитела . Обнаружение генетических материалов позволяет проводить раннюю диагностику заболевания, поскольку обнаружение антигенов и/или антител требует времени для того, чтобы они начали появляться в кровотоке. [1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают этап, который амплифицирует генетический материал, то есть делает много его копий. Такие NAT называются тестами амплификации нуклеиновых кислот ( NAAT ). Существует несколько способов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ смещения цепи (SDA), анализ, опосредованный транскрипцией (TMA), [2] и петлевую изотермическую амплификацию (LAMP). [3]
Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность спаривания оснований Уотсона-Крика ; одноцепочечные зонды или молекулы праймера захватывают целевые молекулы ДНК или РНК комплементарных цепей . Поэтому дизайн цепей зондов имеет большое значение для повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Однако мутанты , которые формируют генетическую основу для различных заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они отличаются только одним основанием, например, вставками , делециями и однонуклеотидными полиморфизмами (SNP). В этом случае может легко возникнуть несовершенное связывание зонда с целью, что приводит к ложноположительным результатам, таким как ошибочное принятие штамма , который является комменсальным , за патогенный. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.
Нити нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями склеиваются в парные цепочки, застегиваясь, как липучка, завернутая в сушилку для белья. Но каждый узел цепочки не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепочка постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. Тесты нуклеиновых кислот используют «зонд», который представляет собой длинную цепочку с прикрепленной к ней короткой цепочкой. Длинная праймерная цепочка имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепочки из обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная цепочка плотно прилипает к открытой части длинной праймерной цепочки (называемой «точкой опоры»), а затем постепенно вытесняет короткую «протекторную» цепочку из зонда. В конце концов, короткая защитная цепочка ни с чем не связана, и несвязанный короткий праймер обнаруживается. Оставшаяся часть этого раздела посвящена истории исследований, необходимых для превращения этого процесса в полезный тест.
В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. [4] Они представили «зонд обмена toehold (PC)», который состоит из предварительно гибридизованной комплементарной цепи C и защитной цепи P. Комплементная цепь длиннее защитной цепи, чтобы иметь несвязанный хвост на конце, toehold. Комплемент идеально комплементарен целевой последовательности. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом обмена toehold (PC), высвобождается P и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд обмена toehold (PC) реагирует с ложной целью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Разница стандартной свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы дать очевидную дискриминацию по выходу. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной гибридизации мишени, деленный на выход ложной гибридизации мишени. В ходе экспериментов с различными зондами обмена toehold с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными изменениями одного основания (замены, делеции и вставки) группа Иня пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов находятся в диапазоне от 3 до 100 + со средним значением 26. Зонды надежно функционируют при температуре от 10 °C до 37 °C, от 1 мМ до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды обмена toehold надежно работают даже при обнаружении РНК.
После этого были проведены дополнительные исследования. В 2013 году группа Силиг опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, которые также используют реакцию обмена опорной точкой. [5] Это позволило оптически обнаружить правильную цель и цель SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.
В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (более 1000) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентными композициями». [6] В этой системе они построили кинетическую модель реакции базовых процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от архитектуры конструкции зонда и слива, а также от концентраций реагентов и условий анализа. Их модель преуспела в медианной 890-кратной селективности для 44 SNV ДНК, связанных с раком, с минимальным значением 200, что представляет собой как минимум 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами на основе гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа последовательностей с низким содержанием VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.
На основе опыта они разработали новый метод ПЦР под названием «Амплификация со смещением блокировщиков» (BDA). [7] Это устойчивая к температуре ПЦР, которая избирательно усиливает все варианты последовательностей в пределах окна примерно в 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно определять сотни потенциальных вариантов, изначально имеющих частоту аллелей ≤ 0,1%. BDA достигает схожих показателей обогащения при температурах отжига от 56 °C до 64 °C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов по всему геному и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные термоциклирующие приборы для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был проверен даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, собранные из плазмы крови пациентов с раком легких.