stringtranslate.com

Мультилокусное типирование последовательностей

Мультилокусное секвенирование ( MLST ) — это метод в молекулярной биологии для типирования нескольких локусов с использованием последовательностей ДНК внутренних фрагментов нескольких генов домашнего хозяйства для характеристики изолятов видов микроорганизмов.

Первая схема MLST была разработана для Neisseria meningitidis , [1] возбудителя менингококкового менингита и септицемии . С момента своего введения для исследования эволюционной истории MLST использовался не только для человеческих патогенов, но и для растительных патогенов. [2]

Принцип

MLST напрямую измеряет вариации последовательности ДНК в наборе генов домашнего хозяйства и характеризует штаммы по их уникальным аллельным профилям. Принцип MLST прост: метод включает ПЦР- амплификацию с последующим секвенированием ДНК . Нуклеотидные различия между штаммами можно проверить на различном количестве генов в зависимости от желаемой степени дискриминации.

Рабочий процесс MLST включает: 1) сбор данных, 2) анализ данных и 3) анализ мультилокусной последовательности. На этапе сбора данных окончательная идентификация вариации достигается путем определения нуклеотидной последовательности фрагментов генов. На этапе анализа данных всем уникальным последовательностям присваиваются номера аллелей, и они объединяются в аллельный профиль и присваиваются тип последовательности (ST). Если обнаруживаются новые аллели и ST, они сохраняются в базе данных после проверки. На заключительном этапе анализа MLST родство изолятов определяется путем сравнения аллельных профилей. Исследователи проводят эпидемиологические и филогенетические исследования, сравнивая ST различных клональных комплексов. В процессе секвенирования и идентификации создается огромный набор данных, поэтому для упорядочивания, управления, анализа и объединения всех биологических данных используются биоинформатические методы.

Чтобы найти баланс между приемлемой идентификационной мощностью, временем и стоимостью типирования штамма, в лабораториях обычно используют около семи-восьми генов домашнего хозяйства. Если привести в пример Staphylococcus aureus , то при типировании MLST используется семь генов домашнего хозяйства. К этим генам относятся карбаматкиназа ( arcC ), шикиматдегидрогеназа ( aroE ), глицеролкиназа ( glpF ), гуанилаткиназа ( gmk ), фосфатацетилтрансфераза ( pta ), триозофосфатизомераза ( tpi ) и ацетилкоэнзим А ацетилтрансфераза ( yqiL ), как указано на веб-сайте MLST. Однако нередко используется до десяти генов домашнего хозяйства. Для Vibrio vulnificus гены домашнего хозяйства, используемые в исследовании, включают глюкозо-6-фосфатизомеразу ( glp ), ДНК-гиразу, субъединицу B ( gyrB ), малат-лактатдегидрогеназу ( mdh ), метионил-тРНК-синтетазу ( metG ), фосфорибозиламиноимидазолсинтетазу ( purM ), треониндегидрогеназу ( dtdS ), диаминопимелатдекарбоксилазу ( lysA ), альфа-субъединицу трансгидрогеназы ( pntA ), дигидрооротазу ( pyrc ) и триптофаназу ( tnaA ). Таким образом, как количество, так и тип генов домашнего хозяйства, опрашиваемых MLST, могут различаться от вида к виду.

Для каждого из этих генов домашнего хозяйства различные последовательности назначаются в качестве аллелей, а аллели в локусах обеспечивают аллельный профиль. Затем ряд профилей может быть идентификационным маркером для типирования штамма. Последовательности, которые отличаются даже одним нуклеотидом, назначаются в качестве различных аллелей, и не дается вес, чтобы учесть количество различий нуклеотидов между аллелями, поскольку мы не можем различить, являются ли различия в нескольких нуклеотидных участках результатом множественных точечных мутаций или одного рекомбинационного обмена. Большое количество потенциальных аллелей в каждом из локусов дает возможность различать миллиарды различных аллельных профилей, и штамм с наиболее распространенным аллелем в каждом локусе, как ожидается, будет встречаться случайно только примерно один раз из 10 000 изолятов. [ необходима цитата ] Несмотря на то, что метод MLST обеспечивает высокую дискриминационную способность, накопление нуклеотидных изменений в генах домашнего хозяйства является относительно медленным процессом, а аллельный профиль бактериального изолята достаточно стабилен с течением времени, что делает этот метод идеальным для глобальной эпидемиологии.

Родство изолятов отображается в виде дендрограммы, построенной с использованием матрицы парных различий между их аллельными профилями, eBURST или минимального связующего дерева (MST). Дендрограмма — это всего лишь удобный способ отображения тех изолятов, которые имеют идентичные или очень похожие аллельные профили, которые можно считать полученными от общего предка; связи между изолятами, которые различаются более чем в трех из семи локусов, вероятно, будут ненадежными и не должны использоваться для вывода об их филогении. [3] [4] MST соединяет все образцы таким образом, что суммарное расстояние всех ветвей дерева минимально. [5]

В качестве альтернативы родство изолятов можно также проанализировать с помощьюАнализ многолокусных последовательностей ( MLSA ). Он не использует назначенные аллели, а вместо этого объединяет последовательности фрагментов генов генов домашнего хозяйства и использует эту объединенную последовательность для определения филогенетических отношений. В отличие от MLST, этот анализ устанавливает более высокое сходство между последовательностями, отличающимися только одним нуклеотидом, и более низкое сходство между последовательностями с множественными различиями нуклеотидов. В результате этот анализ больше подходит для организмов с клональной эволюцией и меньше подходит для организмов, в которых рекомбинационные события происходят очень часто. Его также можно использовать для определения филогенетических отношений между близкородственными видами. [6] Термины MLST и MLSA очень часто считаются взаимозаменяемыми. Однако это неверно, поскольку каждый метод анализа имеет свои отличительные особенности и применение. Следует проявлять осторожность при использовании правильного термина.

Сравнение с другими методами

Ранее были разработаны подходы серологического типирования для дифференциации бактериальных изолятов, но иммунологическое типирование имеет недостатки, такие как зависимость от нескольких антигенных локусов и непредсказуемая реактивность антител с различными антигенными вариантами. Было предложено несколько схем молекулярного типирования для определения родства патогенов, таких как электрофорез в пульсирующем поле ( PFGE ), риботипирование и дактилоскопия на основе ПЦР. Но эти методы субтипирования на основе ДНК-бэндинга не обеспечивают значимых эволюционных анализов. Несмотря на то, что PFGE рассматривается многими исследователями как «золотой стандарт», многие штаммы не типируются этим методом из-за деградации ДНК во время процесса (мазки геля).

Подход MLST отличается от многолокусного электрофореза ферментов (MLEE), который основан на различных электрофоретических подвижностях (ЭП) множественных основных метаболических ферментов. Аллели в каждом локусе определяют ЭП их продуктов, поскольку различные аминокислотные последовательности между ферментами приводят к различным подвижностям и различным полосам при запуске на геле. Затем родство изолятов можно визуализировать с помощью дендрограммы, созданной из матрицы попарных различий между электрофоретическими типами. Этот метод имеет более низкое разрешение, чем MLST, по нескольким причинам, все из которых вытекают из того факта, что разнообразие ферментативного фенотипа является всего лишь прокси для разнообразия последовательностей ДНК. Во-первых, ферменты могут иметь различные аминокислотные последовательности без достаточно различных ЭП, чтобы давать различные полосы. Во-вторых, «молчаливые мутации» могут изменять последовательность ДНК гена, не изменяя закодированные аминокислоты. В-третьих, фенотип фермента может легко изменяться в ответ на условия окружающей среды и плохо влиять на воспроизводимость результатов MLEE - распространенными модификациями ферментов являются фосфорилирование, связывание кофактора и расщепление транспортных последовательностей. Это также ограничивает сопоставимость данных MLEE, полученных разными лабораториями, тогда как MLST предоставляет переносимые и сопоставимые данные о последовательностях ДНК и имеет большой потенциал для автоматизации и стандартизации.

MLST не следует путать с ДНК-штрихкодированием . Последний представляет собой таксономический метод, который использует короткие генетические маркеры для распознавания определенных видов эукариот. Он основан на том факте, что митохондриальная ДНК (мтДНК) или некоторые части рибосомальной ДНК- цистрона имеют относительно высокую скорость мутаций, что приводит к значительным различиям в последовательностях между видами. Методы мтДНК возможны только для эукариот (поскольку у прокариот нет митохондрий), тогда как MLST, хотя изначально и был разработан для прокариот, теперь находит применение и для эукариот и в принципе может быть применен к любому царству.

Преимущества и применение

MLST является в высшей степени однозначным и портативным. Материалы, необходимые для определения ST, могут обмениваться между лабораториями. Последовательности праймеров и протоколы могут быть доступны в электронном виде. Он воспроизводим и масштабируем. MLST автоматизирован, сочетает в себе достижения в высокопроизводительном секвенировании и биоинформатике с устоявшимися методами популяционной генетики. Данные MLST могут использоваться для исследования эволюционных связей между бактериями. MLST обеспечивает хорошую дискриминационную способность для дифференциации изолятов.

Применение MLST огромно и предоставляет ресурс для научных, медицинских и ветеринарных сообществ, а также для пищевой промышленности. Ниже приведены примеры применения MLST.

Кампилобактер

Campylobacter является распространенным возбудителем бактериальных инфекционных кишечных заболеваний, обычно возникающих из-за недоваренной птицы или непастеризованного молока. Однако его эпидемиология плохо изучена, поскольку вспышки выявляются редко, поэтому источники и пути передачи вспышки нелегко отследить. Кроме того, геномы Campylobacter генетически разнообразны и нестабильны с частой меж- и внутригеномной рекомбинацией, а также фазовой изменчивостью, что усложняет интерпретацию данных многих методов типирования. До недавнего времени, с применением техники MLST, типирование Campylobacter достигло большого успеха и было добавлено в базу данных MLST. По состоянию на 1 мая 2008 года база данных MLST Campylobacter содержит 3516 изолятов и около 30 публикаций, в которых используется или упоминается MLST в исследованиях Campylobacter (http://pubmlst.org/campylobacter/).

Neisseria meningitidis

MLST предоставил более богато структурированную картину бактерий в человеческих популяциях и штаммовых вариантов, которые могут быть патогенными для человека, растений и животных. Метод MLST был впервые использован Мейденом и др. (1) для характеристики Neisseria meningitidis с использованием шести локусов. Применение MLST четко определило основные линии менингококков, которые, как известно, ответственны за инвазивные заболевания во всем мире. Для повышения уровня дискриминационной способности между основными инвазивными линиями в настоящее время используются семь локусов, и они были приняты многими лабораториями в качестве метода выбора для характеристики менингококковых изолятов. Хорошо известно [7] , что рекомбинационные обмены обычно происходят в N. meningitidis , что приводит к быстрой диверсификации менингококковых клонов. MLST успешно предоставил надежный метод для характеристики клонов в пределах других видов бактерий, в которых скорости клональной диверсификации, как правило, ниже.

Золотистый стафилококк

S. aureus вызывает ряд заболеваний. Метициллин-резистентный S. aureus ( MRSA ) вызывает растущую обеспокоенность по поводу его устойчивости почти ко всем антибиотикам, кроме ванкомицина. Однако большинство серьезных инфекций S. aureus в обществе и многие в больницах вызваны метициллин-чувствительными изолятами (MSSA), и было предпринято мало попыток идентифицировать гипервирулентные клоны MSSA, связанные с серьезным заболеванием. Поэтому MLST был разработан для предоставления однозначного метода характеристики клонов MRSA и для идентификации клонов MSSA, связанных с серьезным заболеванием.

Streptococcus pyogenes

S. pyogenes вызывает заболевания от фарингита до опасного для жизни импетиго, включая некротизирующий фасциит.Разработана схема MLST для S. pyogenes . В настоящее время база данных (mlst.net) [8] содержит аллельные профили изолятов, которые представляют мировое разнообразие организма, а также изоляты от серьезных инвазивных заболеваний. [9]

Кандида альбиканс

C. albicans — грибковый патоген человека, вызывающий внутрибольничные инфекции кровотока. Метод MLST использовался для характеристики изолятов C. albicans . Сочетание аллелей в разных локусах приводит к получению уникальных типов диплоидных последовательностей, которые можно использовать для различения штаммов. Было показано, что MLST успешно применяется для изучения эпидемиологии C. albicans в больнице, а также разнообразия изолятов C. albicans , полученных из различных экологических ниш, включая хозяев-людей и животных.

Кронобактерии

Род Cronobacter состоит из 7 видов. До 2007 года для этих организмов применялось единое видовое название Enterobacter sakazakii . Первоначально схема Cronobacter MLST применялась для различения C. sakazakii и C. malonaticus , поскольку секвенирование 16S рДНК не всегда достаточно точно, а биотипирование слишком субъективно. [10] Схема Cronobacter MLST использует 7 аллелей: atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB и ppsA, что дает конкатенированную последовательность из 3036 п.н. для филогенетического анализа (MLSA) и сравнительной геномики . [11] MLST также использовался для формального распознавания новых видов Cronobacter . [12] Метод выявил сильную связь между одной генетической линией, последовательностью типа 4 (ST4), и случаями неонатального менингита. [13] Сайт Cronobacter MLST находится по адресу http://www.pubMLST.org/cronobacter.

Ограничения

MLST лучше всего подходит для популяционного генетического исследования, но он дорогой. Из-за сохранения последовательностей в генах домашнего хозяйства MLST иногда не хватает дискриминационной способности для дифференциации бактериальных штаммов, что ограничивает его использование в эпидемиологических исследованиях. Для улучшения дискриминационной способности MLST был разработан подход типирования последовательностей множественных локусов вирулентности (MVLST) с использованием Listeria monocytogenes . [14] MVLST расширяет преимущества MLST, но нацелен на гены вирулентности, которые могут быть более полиморфными, чем гены домашнего хозяйства. Популяционная генетика — не единственный значимый фактор в эпидемии. Факторы вирулентности также важны для возникновения заболевания, и популяционные генетические исследования с трудом их отслеживают. Это связано с тем, что вовлеченные гены часто сильно рекомбинируют и мобильны между штаммами по сравнению с популяционной генетической структурой. Таким образом, например, в Escherichia coli идентификация штаммов, несущих гены токсинов, важнее, чем оценка распространенных штаммов на основе популяционной генетики.

Появление технологий секвенирования второго поколения сделало возможным получение информации о последовательности по всему бактериальному геному при относительно скромных затратах и ​​усилиях, и MLST теперь может быть назначен на основе информации о последовательности всего генома, а не секвенирования каждого локуса отдельно, как это было принято, когда MLST был впервые разработан. [15] Полногеномное секвенирование дает более богатую информацию для дифференциации бактериальных штаммов (MLST использует приблизительно 0,1% геномной последовательности для назначения типа, игнорируя остальную часть бактериального генома). Например, полногеномное секвенирование многочисленных изолятов выявило единственную линию MLST ST258 Klebsiella pneumoniae , состоящую из двух отдельных генетических кладов, [16] предоставляя дополнительную информацию об эволюции и распространении этих организмов с множественной лекарственной устойчивостью и опровергая предыдущую гипотезу о едином клональном происхождении ST258. [17]

Базы данных

Базы данных MLST содержат референтные аллельные последовательности и типы последовательностей для каждого организма, а также изолируют эпидемиологические данные. Веб-сайты содержат программное обеспечение для опроса и анализа, которое позволяет пользователям запрашивать свои аллельные последовательности и типы последовательностей. MLST широко используется в качестве инструмента для исследователей и работников общественного здравоохранения.

Большинство баз данных MLST размещены на веб-сервере, который в настоящее время находится в Оксфордском университете (pubmlst.org).

База данных, размещенная на сайте, содержит референтные последовательности аллелей, специфичные для конкретных организмов, а также списки ST для отдельных организмов.

Для облегчения сбора и форматирования используемых последовательностей был разработан простой и бесплатный плагин для Firefox (ссылка заархивирована 22.02.2014 на Wayback Machine ).

Ссылки

  1. ^ Maiden, MC.; Bygraves, JA.; Feil, E.; Morelli, G.; Russell, JE.; Urwin, R.; Zhang, Q.; Zhou, J.; et al. (март 1998 г.). «Мультилокусное последовательностное типирование: портативный подход к идентификации клонов в популяциях патогенных микроорганизмов». Proc Natl Acad Sci USA . 95 (6): 3140–5. Bibcode : 1998PNAS...95.3140M. doi : 10.1073/pnas.95.6.3140 . PMC  19708. PMID  9501229.
  2. ^ Sarris, PF; Trantas, EA; Mpalantinaki, E; Ververidis, F; Goumas, DE (2012). "Pseudomonas viridiflava, патоген растений с несколькими хозяевами и значительной генетической изменчивостью на молекулярном уровне". PLOS ONE . 7 (4): e36090. Bibcode : 2012PLoSO...736090S. doi : 10.1371/journal.pone.0036090 . PMC 3338640. PMID  22558343 . 
  3. ^ Спратт, Брайан Г. (1999). «Мультилокусное типирование последовательностей: молекулярное типирование бактериальных патогенов в эпоху быстрого секвенирования ДНК и Интернета». Current Opinion in Microbiology . 2 (3): 312–316. doi :10.1016/S1369-5274(99)80054-X. PMID  10383857.
  4. ^ Spratt, BG; Maiden, MC (1999). «Бактериальная популяционная генетика, эволюция и эпидемиология». Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 354 (1384): 701–710. doi :10.1098/rstb.1999.0423. PMC 1692550. PMID  10365396 . 
  5. ^ Джолли, Кит. "Minimum Spanning Tree". pubMLST. Архивировано из оригинала 15 сентября 2007 г. Получено 10 октября 2013 г.
  6. ^ Геверс Д., Кохан Ф.М., Лоуренс Дж.Г., Спратт Б.Г., Коэнье Т., Фейл Э.Дж., Стакебрандт Э., Ван де Пер Ю., Вандамм П., Томпсон Ф.Л., Свингс Дж. (2005). «Мнение: переоценка видов прокариот». Nat Rev Микробиол . 3 (9): 733–739. дои : 10.1038/nrmicro1236. PMID  16138101. S2CID  41706247.
  7. ^ EJ Feil; MC Maiden; M Achtman; BG Spratt (1999). «Относительный вклад рекомбинации и мутации в расхождение клонов Neisseria meningitidis». Mol Biol Evol . 16 (11): 1496–1502. doi : 10.1093/oxfordjournals.molbev.a026061 . PMID  10555280.
  8. ^ Enright MC, Spratt BG, Kalia A, Cross JH, Bessen DE (2001). «Мультилокусное типирование последовательностей Streptococcus pyogenes и отношения между типом emm и клоном». Infect Immun . 69 (4): 2416–2427. doi :10.1128/ iai.69.4.2416-2427.2001 . PMC 98174. PMID  11254602. 
  9. ^ McGregor KF, Spratt BG, Kalia A, Bennett A, Bilek N, Beall B, Bessen DE (2004). «Мультилокусное типирование последовательностей Streptococcus pyogenes, представляющее большинство известных типов emm и различия среди субпопуляционных генетических структур». J Bacteriol . 186 (13): 4285–4294. doi :10.1128/jb.186.13.4285-4294.2004. PMC 421626. PMID  15205431 . 
  10. ^ Болдуин и др. (2009). «Мультилокусное типирование последовательностей Cronobacter sakazakii и Cronobacter malonaticus выявляет стабильные клональные структуры с клинической значимостью, которые не коррелируют с биотипами». BMC Microbiology . 9 : 223. doi : 10.1186/1471-2180-9-223 . PMC 2770063 . PMID  19852808. 
  11. ^ Кучерова; и др. (2011). «Cronobacter: разнообразие и повсеместность». Обеспечение качества и безопасность пищевых продуктов и сельскохозяйственных культур . 3 (3): 104–122. doi :10.1111/j.1757-837X.2011.00104.x.
  12. ^ Джозеф и др. (2011). «Cronobacter condimenti sp. nov., выделенный из мяса со специями, и Cronobacter universalis sp. nov., новое обозначение вида для Cronobacter sp. genomospecies 1, выделенный из инфекции ног, воды и пищевых ингредиентов». Int J Syst Evol Microbiol . 62 (Pt 6): 1277–83. doi : 10.1099/ijs.0.032292-0 . PMID  22661070.
  13. ^ Джозеф и Форсайт (2011). «Связь Cronobacter sakazakii ST4 с неонатальными инфекциями». Новые инфекционные заболевания . 17 (9): 1713–5. doi :10.3201/eid1709.110260. PMC 3322087. PMID  21888801 . 
  14. ^ Чжан, В.; Джаярао, Б. М.; Кнабель, С. Дж. (2004). «Типирование последовательностей локусов мультивирулентности Listeria monocytogenes». Прикладная и экологическая микробиология . 70 (2): 913–920. Bibcode : 2004ApEnM..70..913Z. doi : 10.1128/AEM.70.2.913-920.2004. ISSN  0099-2240. PMC 348834. PMID 14766571  . 
  15. ^ «Центр геномной эпидемиологии».
  16. ^ ДеЛео, Ф.; и др. (2014). «Молекулярное препарирование эволюции устойчивой к карбапенемам мультилокусной последовательности типа 258 Klebsiella pneumoniae». Труды Национальной академии наук . 111 (13): 4988–93. Bibcode : 2014PNAS..111.4988D. doi : 10.1073/pnas.1321364111 . PMC 3977278. PMID  24639510 . 
  17. ^ Woodford N, Turton JF, Livermore DM; Turton; Livermore (2011). «Мультирезистентные грамотрицательные бактерии: роль клонов высокого риска в распространении устойчивости к антибиотикам». FEMS Microbiology Reviews . 35 (5): 736–55. doi :10.1111/j.1574-6976.2011.00268.x. PMID  21303394.{{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки