Трансдукция — это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом или вирусным вектором . [1] Примером является вирусный перенос ДНК от одной бактерии к другой и, следовательно, пример горизонтального переноса генов . [2] Трансдукция не требует физического контакта между клеткой, отдающей ДНК, и клеткой, получающей ДНК (что происходит при конъюгации ), и она устойчива к ДНКазе ( трансформация восприимчива к ДНКазе). Трансдукция — это распространенный инструмент, используемый молекулярными биологами для стабильного введения чужеродного гена в геном клетки-хозяина (как бактериальных, так и млекопитающих).
Трансдукция была открыта у сальмонелл Нортоном Зиндером и Джошуа Ледербергом в Университете Висконсин-Мэдисон в 1952 году. [3]
Трансдукция происходит либо через литический цикл, либо через лизогенный цикл. Когда бактериофаги (вирусы, которые заражают бактерии), которые являются литическими, заражают бактериальные клетки, они используют репликационный , транскрипционный и трансляционный аппараты бактериальной клетки-хозяина для создания новых вирусных частиц ( вирионов ). Затем новые фаговые частицы высвобождаются путем лизиса хозяина. В лизогенном цикле фаговая хромосома интегрируется как профаг в бактериальную хромосому, где она может оставаться в состоянии покоя в течение длительных периодов времени. Если профаг индуцируется (например, ультрафиолетовым светом), геном фага вырезается из бактериальной хромосомы и инициирует литический цикл, который завершается лизисом клетки и высвобождением фаговых частиц. Генерализованная трансдукция (см. ниже) происходит в обоих циклах во время литической стадии, в то время как специализированная трансдукция (см. ниже) происходит, когда профаг вырезается в лизогенном цикле. [ необходима цитата ]
Упаковка ДНК бактериофага в капсиды фага имеет низкую точность. Небольшие фрагменты бактериальной ДНК могут быть упакованы в частицы бактериофага. Существует два способа, которыми это может привести к трансдукции. [ необходима цитата ]
Генерализованная трансдукция происходит, когда случайные фрагменты бактериальной ДНК упаковываются в фаг. Это происходит, когда фаг находится в литической стадии, в тот момент, когда вирусная ДНК упаковывается в головки фага. Если вирус реплицируется с использованием «упаковки с головой», он пытается заполнить головку генетическим материалом. Если вирусный геном приводит к появлению резервной емкости, механизмы вирусной упаковки могут включать бактериальный генетический материал в новый вирион. В качестве альтернативы генерализованная трансдукция может происходить посредством рекомбинации . Генерализованная трансдукция является редким событием и происходит примерно у 1 фага из 11 000.
Новая вирусная капсула, которая содержит часть бактериальной ДНК, затем заражает другую бактериальную клетку. Когда бактериальная ДНК, упакованная в вирус, вставляется в клетку-реципиент, с ней могут произойти три вещи: [ необходима цитата ] [4]
Специализированная трансдукция — это процесс, при котором ограниченный набор бактериальных генов переносится в другую бактерию. Те гены, которые расположены рядом с профагом, переносятся из-за неправильного вырезания. Специализированная трансдукция происходит, когда профаг вырезает неточно из хромосомы, так что бактериальные гены, лежащие рядом с ним, включаются в вырезанную ДНК. Вырезанная ДНК вместе с вирусной ДНК затем упаковывается в новую вирусную частицу, которая затем доставляется в новую бактерию, когда фаг атакует новую бактерию. Здесь донорские гены могут быть вставлены в хромосому-реципиент или оставаться в цитоплазме, в зависимости от природы бактериофага. [ необходима цитата ]
Когда частично инкапсулированный фаговый материал заражает другую клетку и становится профагом, частично закодированная ДНК профага называется «гетерогенотой». [ необходима цитата ]
Примером специализированной трансдукции является фаг λ в Escherichia coli . [5]
Латеральная трансдукция — это процесс, посредством которого очень длинные фрагменты бактериальной ДНК переносятся в другую бактерию. До сих пор эта форма трансдукции была описана только у Staphylococcus aureus , но она может переносить больше генов и с более высокой частотой, чем генерализованная и специализированная трансдукция. При латеральной трансдукции профаг начинает свою репликацию in situ перед вырезанием в процессе, который приводит к репликации соседней бактериальной ДНК. После чего упаковка реплицированного фага из его pac- сайта (расположенного примерно в середине генома фага) и соседних бактериальных генов происходит in situ, до 105% размера генома фага. Последовательная упаковка после инициации с исходного pac- сайта приводит к упаковке нескольких килобаз бактериальных генов в новые вирусные частицы, которые переносятся в новые бактериальные штаммы. Если перенесенный генетический материал в этих трансдуцирующих частицах обеспечивает достаточное количество ДНК для гомологичной рекомбинации, генетический материал будет вставлен в хромосому реципиента. Поскольку во время репликации in situ образуются множественные копии генома фага, некоторые из этих реплицированных профагов вырезаются нормально (вместо того, чтобы упаковываться in situ), образуя нормальные инфекционные фаги. [6]
Трансдукция с вирусными векторами может быть использована для вставки или модификации генов в клетках млекопитающих. Она часто используется как инструмент в фундаментальных исследованиях и активно изучается как потенциальное средство для генной терапии . [ необходима цитата ]
В этих случаях конструируется плазмида, в которой гены, которые должны быть переданы, фланкированы вирусными последовательностями, которые используются вирусными белками для распознавания и упаковки вирусного генома в вирусные частицы. Эта плазмида вставляется (обычно путем трансфекции ) в клетку-продуцент вместе с другими плазмидами (конструкциями ДНК), которые несут вирусные гены, необходимые для образования инфекционных вирионов . В этих клетках-продуцентах вирусные белки, экспрессируемые этими упаковочными конструкциями, связывают последовательности на ДНК/РНК (в зависимости от типа вирусного вектора), которые должны быть переданы, и вставляют их в вирусные частицы. В целях безопасности ни одна из используемых плазмид не содержит всех последовательностей, необходимых для образования вируса, поэтому для получения инфекционных вирионов требуется одновременная трансфекция нескольких плазмид. Более того, только плазмида, несущая последовательности, которые должны быть переданы, содержит сигналы, которые позволяют упаковывать генетические материалы в вирионы, так что ни один из генов, кодирующих вирусные белки, не упаковывается. Вирусы, собранные из этих клеток, затем применяются к клеткам, которые должны быть изменены. Начальные стадии этих инфекций имитируют заражение естественными вирусами и приводят к экспрессии перенесенных генов и (в случае лентивирусных /ретровирусных векторов) вставке ДНК, которая должна быть перенесена, в клеточный геном. Однако, поскольку перенесенный генетический материал не кодирует ни один из вирусных генов, эти инфекции не генерируют новые вирусы (вирусы являются «репликаторно-дефицитными»). [ необходима цитата ]
Для повышения эффективности трансдукции использовались некоторые усилители, такие как полибрен , протаминсульфат , ретронектин и декстран DEAE. [7]