Первичный транскрипт — это одноцепочечный продукт рибонуклеиновой кислоты ( РНК ), синтезированный путем транскрипции ДНК и обработанный для получения различных зрелых продуктов РНК, таких как мРНК , тРНК и рРНК . Первичные транскрипты, обозначенные как мРНК, модифицируются при подготовке к трансляции . Например, предшественник мРНК (пре-мРНК) — это тип первичного транскрипта, который становится информационной РНК (мРНК) после процессинга .
Пре-мРНК синтезируется из ДНК- матрицы в ядре клетки путем транскрипции . Пре-мРНК включает в себя большую часть гетерогенной ядерной РНК (hnRNA). После того, как пре-мРНК полностью обработана , ее называют « зрелой информационной РНК » или просто « информационной РНК ». Термин hnRNA часто используется как синоним пре-мРНК, хотя, в строгом смысле, hnRNA может включать в себя ядерные транскрипты РНК, которые не заканчиваются как цитоплазматическая мРНК.
Существует несколько этапов , способствующих производству первичных транскриптов. Все эти этапы включают ряд взаимодействий для инициирования и завершения транскрипции ДНК в ядре эукариот . Определенные факторы играют ключевую роль в активации и ингибировании транскрипции, где они регулируют производство первичного транскрипта. Транскрипция производит первичные транскрипты, которые далее модифицируются несколькими процессами. Эти процессы включают 5'-кэп , 3'-полиаденилирование и альтернативный сплайсинг . В частности, альтернативный сплайсинг напрямую способствует разнообразию мРНК, обнаруженной в клетках. Модификации первичных транскриптов были дополнительно изучены в исследованиях, стремящихся к более глубоким знаниям о роли и значении этих транскриптов. Экспериментальные исследования, основанные на молекулярных изменениях первичных транскриптов и процессах до и после транскрипции, привели к более глубокому пониманию заболеваний, связанных с первичными транскриптами.
Шаги, способствующие производству первичных транскриптов, включают ряд молекулярных взаимодействий, которые инициируют транскрипцию ДНК в ядре клетки. В зависимости от потребностей данной клетки определенные последовательности ДНК транскрибируются для получения различных продуктов РНК, которые будут транслироваться в функциональные белки для использования в клетке. Для инициирования процесса транскрипции в ядре клетки двойные спирали ДНК раскручиваются, а водородные связи , соединяющие совместимые нуклеиновые кислоты ДНК, разрываются для получения двух несвязанных одиночных цепей ДНК. [1] Одна цепь шаблона ДНК используется для транскрипции одноцепочечной первичной транскриптной мРНК. Эта цепь ДНК связана РНК-полимеразой в промоторной области ДНК. [2]
У эукариот три вида РНК — рРНК , тРНК и мРНК — производятся на основе активности трех различных РНК-полимераз, тогда как у прокариот существует только одна РНК-полимераза для создания всех видов молекул РНК. [3] РНК-полимераза II эукариот транскрибирует первичный транскрипт, транскрипт, предназначенный для переработки в мРНК, с антисмысловой ДНК-матрицы в направлении от 5' к 3', и этот вновь синтезированный первичный транскрипт комплементарен антисмысловой цепи ДНК. [1] РНК-полимераза II конструирует первичный транскрипт, используя набор из четырех специфических остатков рибонуклеозидмонофосфата ( аденозинмонофосфат ( AMP), цитидинмонофосфат (CMP) , гуанозинмонофосфат (GMP) и уридинмонофосфат (UMP)), которые непрерывно добавляются к 3'-гидроксильной группе на 3'-конце растущей мРНК. [1]
Исследования первичных транскриптов, полученных с помощью РНК-полимеразы II, показывают, что средняя длина первичного транскрипта составляет 7000 нуклеотидов , а некоторые достигают длины 20000 нуклеотидов. [2] Включение как экзонных , так и интронных последовательностей в первичные транскрипты объясняет разницу в размерах между более крупными первичными транскриптами и более мелкими, зрелыми мРНК, готовыми к трансляции в белок. [ необходима ссылка ]
Ряд факторов способствуют активации и ингибированию транскрипции и, следовательно, регулируют производство первичных транскриптов из заданной матрицы ДНК. [ необходима цитата ]
Активация активности РНК-полимеразы для получения первичных транскриптов часто контролируется последовательностями ДНК, называемыми энхансерами . Факторы транскрипции , белки, которые связываются с элементами ДНК, чтобы активировать или подавлять транскрипцию, связываются с энхансерами и привлекают ферменты, которые изменяют компоненты нуклеосомы , в результате чего ДНК становится более или менее доступной для РНК-полимеразы. Уникальные комбинации активирующих или ингибирующих факторов транскрипции, которые связываются с областями ДНК энхансера, определяют, активирован ли ген, с которым взаимодействует энхансер, для транскрипции или нет. [4] Активация транскрипции зависит от того, может ли комплекс удлинения транскрипции, состоящий из множества факторов транскрипции, заставить РНК-полимеразу диссоциировать от комплекса Медиатора , который соединяет область энхансера с промотором. [4]
Ингибирование активности РНК-полимеразы также может регулироваться последовательностями ДНК, называемыми сайленсерами . Как и энхансеры, сайленсеры могут располагаться в местах, расположенных выше или ниже генов, которые они регулируют. Эти последовательности ДНК связываются с факторами, которые способствуют дестабилизации комплекса инициации, необходимого для активации РНК-полимеразы, и, следовательно, ингибируют транскрипцию. [5]
Модификация гистонов факторами транскрипции является еще одним ключевым регуляторным фактором для транскрипции РНК-полимеразой. В целом, факторы, которые приводят к ацетилированию гистонов, активируют транскрипцию, в то время как факторы, которые приводят к деацетилированию гистонов, ингибируют транскрипцию. [6] Ацетилирование гистонов вызывает отталкивание между отрицательными компонентами внутри нуклеосом, что обеспечивает доступ РНК-полимеразы. Деацетилирование гистонов стабилизирует плотно скрученные нуклеосомы, ингибируя доступ РНК-полимеразы. В дополнение к паттернам ацетилирования гистонов, паттерны метилирования в промоторных областях ДНК могут регулировать доступ РНК-полимеразы к заданной матрице. РНК-полимераза часто неспособна синтезировать первичный транскрипт, если промоторная область целевого гена содержит специфические метилированные цитозины — остатки, которые препятствуют связыванию факторов, активирующих транскрипцию, и привлекают другие ферменты для стабилизации прочно связанной структуры нуклеосомы, исключая доступ РНК-полимеразы и предотвращая производство первичных транскриптов. [4]
R-петли образуются во время транскрипции. R-петля представляет собой трехцепочечную структуру нуклеиновой кислоты, содержащую гибридную область ДНК-РНК и связанную нешаблонную одноцепочечную ДНК. Активно транскрибируемые области ДНК часто образуют R-петли, которые уязвимы для повреждения ДНК . Интроны уменьшают образование R-петли и повреждение ДНК в высокоэкспрессируемых генах дрожжей. [7]
Повреждения ДНК возникают в каждой клетке каждый день, причем число повреждений в каждой клетке достигает десятков или сотен тысяч, и такие повреждения ДНК могут препятствовать первичной транскрипции. [8] Сам процесс экспрессии генов является источником эндогенных повреждений ДНК, возникающих из-за восприимчивости одноцепочечной ДНК к повреждениям. [8] Другими источниками повреждений ДНК являются конфликты первичного транскрипционного аппарата с аппаратом репликации ДНК и активность определенных ферментов, таких как топоизомеразы и ферменты репарации эксцизионных оснований . Несмотря на то, что эти процессы строго регулируются и обычно точны, иногда они могут совершать ошибки и оставлять после себя разрывы ДНК, которые приводят к хромосомным перестройкам или гибели клетки . [8]
Транскрипция, высокорегулируемая фаза экспрессии генов, производит первичные транскрипты. Однако транскрипция — это только первый шаг, за которым должно следовать множество модификаций, которые дают функциональные формы РНК. [9] Иначе говоря, вновь синтезированные первичные транскрипты модифицируются несколькими способами, чтобы преобразоваться в их зрелые, функциональные формы для производства различных белков и РНК, таких как мРНК, тРНК и рРНК. [ необходима цитата ]
Основной процесс модификации первичного транскрипта схож для тРНК и рРНК как в эукариотических, так и в прокариотических клетках. С другой стороны, первичный процессинг транскрипта различается в мРНК прокариотических и эукариотических клеток. [9] Например, некоторые прокариотические бактериальные мРНК служат матрицами для синтеза белков в то же время, когда они производятся посредством транскрипции. Альтернативно, пре-мРНК эукариотических клеток претерпевают широкий спектр модификаций до их транспортировки из ядра в цитоплазму, где их зрелые формы транслируются. [9] Эти модификации отвечают за различные типы закодированных сообщений, которые приводят к трансляции различных типов продуктов. Кроме того, первичный процессинг транскрипта обеспечивает контроль экспрессии генов, а также регуляторный механизм для скоростей деградации мРНК. Процессинг пре-мРНК в эукариотических клетках включает 5'-кэпирование , 3'-полиаденилирование и альтернативный сплайсинг . [ требуется ссылка ]
Вскоре после начала транскрипции у эукариот 5'-конец пре-мРНК модифицируется путем добавления 7-метилгуанозинового колпачка , также известного как 5'-кэп. [9] Модификация 5'-кэпирования инициируется путем добавления GTP к 5'-концевому нуклеотиду пре-мРНК в обратной ориентации с последующим добавлением метильных групп к остатку G. [9] 5'-кэпирование необходимо для производства функциональных мРНК, поскольку 5'-кэп отвечает за выравнивание мРНК с рибосомой во время трансляции. [9]
У эукариот полиаденилирование дополнительно модифицирует пре-мРНК, в ходе чего добавляется структура, называемая поли-А-хвостом . [9] Сигналы для полиаденилирования, которые включают несколько элементов последовательности РНК, обнаруживаются группой белков, которые сигнализируют о добавлении поли-А-хвоста (длиной около 200 нуклеотидов). Реакция полиаденилирования обеспечивает сигнал для окончания транскрипции, и эта реакция заканчивается примерно в нескольких сотнях нуклеотидов ниже по течению от расположения поли-А-хвоста. [9]
Интроны эукариотических пре-мРНК вырезаются сплайсосомами, состоящими из небольших ядерных рибонуклеопротеинов . [10] [11]
В сложных эукариотических клетках один первичный транскрипт способен подготовить большое количество зрелых мРНК благодаря альтернативному сплайсингу. Альтернативный сплайсинг регулируется таким образом, что каждая зрелая мРНК может кодировать множество белков.
Эффект альтернативного сплайсинга в экспрессии генов можно наблюдать у сложных эукариот, которые имеют фиксированное количество генов в своем геноме, но производят гораздо большее количество различных генных продуктов. [9] Большинство транскриптов пре-мРНК эукариот содержат несколько интронов и экзонов. Различные возможные комбинации 5' и 3' участков сплайсинга в пре-мРНК могут приводить к разному вырезанию и комбинированию экзонов, в то время как интроны удаляются из зрелой мРНК. Таким образом, генерируются различные виды зрелых мРНК. [9] Альтернативный сплайсинг происходит в большом белковом комплексе, называемом сплайсосомой . Альтернативный сплайсинг имеет решающее значение для тканеспецифической и развивающей регуляции экспрессии генов. [9] На альтернативный сплайсинг могут влиять различные факторы, включая мутации, такие как хромосомная транслокация .
У прокариот сплайсинг осуществляется посредством автокаталитического расщепления или эндолитического расщепления. Автокаталитические расщепления, в которых не участвуют белки, обычно зарезервированы для участков, кодирующих рРНК, тогда как эндолитическое расщепление соответствует предшественникам тРНК.
5- Воздействие фторурацила (FUra) на резистентные к метотрексату клетки KB привело к двукратному снижению общего уровня мРНК дигидрофолатредуктазы (DHFR), в то время как уровень пре-мРНК DHFR с определенными интронами остался неизменным. Период полураспада мРНК DHFR или пре-мРНК существенно не изменился, но скорость перехода РНК DHFR из ядра в цитоплазму снизилась, что позволяет предположить, что FUra может влиять на процессинг мРНК и/или стабильность ядерной мРНК DHFR. [12]
У Drosophila и Aedes размер hnRNA (пре-мРНК) был больше у Aedes из-за его большего генома, несмотря на то, что оба вида производят зрелую мРНК схожего размера и сложности последовательности. Это указывает на то, что размер hnRNA увеличивается с размером генома. [13]
В клетках HeLa группы сплайсосом на пре-мРНК были обнаружены в ядерных спеклах , причем это формирование зависит от температуры и находится под влиянием специфических последовательностей РНК. Нацеливание пре-мРНК и загрузка факторов сплайсинга в спеклах были критическими для формирования групп сплайсосом, что приводило к пятнистому рисунку. [14]
Привлечение пре-мРНК к ядерным спеклам значительно увеличило эффективность сплайсинга и уровень белка, что указывает на то, что близость к спеклам повышает эффективность сплайсинга. [15]
Исследования также привели к более глубоким знаниям об определенных заболеваниях, связанных с изменениями в первичных транскриптах. Одно исследование касалось рецепторов эстрогена и дифференциального сплайсинга. Статья под названием «Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта человеческого рецептора эстрогена альфа: механизмы пропуска экзона» Паолы Ферро, Алессандры Форлани, Марко Муселли и Ульриха Пфеффера из лаборатории молекулярной онкологии Национального института исследований рака в Генуе, Италия, объясняет, что 1785 нуклеотидов области в ДНК, которая кодирует рецептор эстрогена альфа (ER-альфа), распределены по области, которая содержит более 300 000 нуклеотидов в первичном транскрипте. Сплайсинг этой пре-мРНК часто приводит к вариантам или различным видам мРНК, в которых отсутствует один или несколько экзонов или областей, необходимых для кодирования белков. Эти варианты были связаны с прогрессированием рака молочной железы . [16] В жизненном цикле ретровирусов провирусная ДНК включается в транскрипцию ДНК инфицированной клетки. Поскольку ретровирусам необходимо изменить свою пре-мРНК в ДНК, чтобы эта ДНК могла быть интегрирована в ДНК хозяина, на которого она воздействует, формирование этой матрицы ДНК является жизненно важным шагом для репликации ретровируса. Тип клетки, дифференциация или измененное состояние клетки и физиологическое состояние клетки приводят к значительному изменению доступности и активности определенных факторов, необходимых для транскрипции. Эти переменные создают широкий спектр экспрессии вирусных генов. Например, клетки культуры тканей, активно продуцирующие инфекционные вирионы вирусов лейкемии птиц или мышей (ASLV или MLV), содержат такие высокие уровни вирусной РНК, что 5–10% мРНК в клетке могут иметь вирусное происхождение. Это показывает, что первичные транскрипты, продуцируемые этими ретровирусами, не всегда следуют нормальному пути производства белка и преобразуются обратно в ДНК для размножения и расширения. [17]