уравнение Шильда

График прямой линии, подобранный к гипотетическим точкам. График Шильда обратимого конкурентного антагониста должен быть прямой линией с линейным градиентом, точка пересечения с осью Y которого соответствует силе антагониста.

В фармакологии регрессионный анализ Шильда , основанный на уравнении Шильда (оба названы в честь Хайнца Отто Шильда) , является инструментом для изучения влияния агонистов и антагонистов на реакцию, вызванную рецептором , или на связывание лиганда с рецептором.

Концепция

Кривые доза-реакция могут быть построены для описания реакции или образования комплекса лиганд-рецептор как функции концентрации лиганда. Антагонисты затрудняют образование этих комплексов, ингибируя взаимодействия лиганда с его рецептором. Это рассматривается как изменение кривой доза-реакция: обычно сдвиг вправо или пониженный максимум. Обратимый конкурентный антагонист должен вызывать сдвиг вправо кривой доза-реакция, так что новая кривая будет параллельна старой, а максимум не изменится. Это происходит потому, что обратимые конкурентные антагонисты являются преодолимыми антагонистами. Величина сдвига вправо может быть количественно определена с помощью соотношения доз r. Соотношение доз r представляет собой отношение дозы агониста, необходимой для полумаксимального ответа с присутствующим антагонистом, деленное на агонист, необходимый для полумаксимального ответа без антагониста («контроль»). Другими словами, отношение EC50 ингибированной и неингибированной кривых. Таким образом, r представляет как силу антагониста, так и концентрацию антагониста, который был применен. Уравнение, полученное из уравнения Гаддума, может быть использовано для связи r с , следующим образом: ${\displaystyle {\ce {B}}}$ ${\displaystyle [{\ce {B}}]}$

${\displaystyle r=1+{\frac {[{\ce {B}}]}{K_{B}}}}$

где

• r — отношение доз
• ${\displaystyle [{\ce {B}}]}$это концентрация антагониста
• ${\displaystyle K_{B}}$константа равновесия связывания антагониста с рецептором

График Шильда — это двойной логарифмический график, обычно в виде ординаты и абсциссы . Это делается путем взятия логарифма по основанию 10 от обеих сторон предыдущего уравнения после вычитания 1: ${\displaystyle \log _{10}(r-1)}$ ${\displaystyle \log _{10}[{\ce {B}}]}$

${\displaystyle \log _{10}(r-1)=\log _{10}[{\ce {B}}]-\log _{10}(K_{B})}$

Это уравнение линейно относительно , ​​что позволяет легко строить графики без вычислений. Это было особенно ценно до того, как использование компьютеров в фармакологии стало широко распространенным. Y-пересечение уравнения представляет собой отрицательный логарифм и может использоваться для количественной оценки силы антагониста. ${\displaystyle \log _{10}[{\ce {B}}]}$ ${\displaystyle K_{B}}$

Эти эксперименты должны проводиться в очень широком диапазоне (поэтому в логарифмической шкале), поскольку механизмы различаются в больших масштабах, например, при высокой концентрации препарата. ^{[ необходима цитата ]}

Подгонку графика Шильда к наблюдаемым точкам данных можно выполнить с помощью регрессионного анализа .

Регрессия Шильда для связывания лиганда

Хотя большинство экспериментов используют клеточный ответ в качестве меры эффекта, эффект, по сути, является результатом кинетики связывания; поэтому для иллюстрации механизма используется связывание лиганда . Лиганд A будет связываться с рецептором R в соответствии с константой равновесия:

${\displaystyle K_{d}={\frac {k_{-1}}{k_{1}}}}$

Хотя константа равновесия более значима, в текстах часто упоминается ее обратная величина — константа сродства (K _aff = k ₁ /k ₋₁ ): лучшее связывание означает увеличение сродства связывания.

Уравнение связывания простого лиганда с одним гомогенным рецептором имеет вид

${\displaystyle [AR]={\frac {[R]_{t}\,[A]}{[A]+K_{d}}}}$^{[ требуется разъяснение ]}

Это уравнение Хилла-Ленгмюра, которое практически является уравнением Хилла , описанным для связывания агониста. В химии это соотношение называется уравнением Ленгмюра , которое описывает адсорбцию молекул на участках поверхности (см. адсорбция ).

${\displaystyle [R]_{t}}$— это общее количество мест связывания, и когда уравнение построено, это горизонтальная асимптота, к которой стремится график; больше мест связывания будет занято по мере увеличения концентрации лиганда, но никогда не будет 100% занятости. Сродство связывания — это концентрация, необходимая для занятия 50% мест; чем ниже это значение, тем легче лиганду занять место связывания.

Связывание лиганда с рецептором в равновесном состоянии следует той же кинетике, что и фермент в стационарном состоянии ( уравнение Михаэлиса–Ментен ) без превращения связанного субстрата в продукт.

Агонисты и антагонисты могут оказывать различные эффекты на связывание лиганда. Они могут изменять максимальное количество мест связывания, сродство лиганда к рецептору, оба эффекта вместе или даже более странные эффекты, когда изучаемая система более интактна, например, в образцах тканей. (Поглощение тканью, десенсибилизация и другие неравновесные стационарные состояния могут быть проблемой.)

Преодолимое лекарство изменяет сродство связывания:

• конкурентный лиганд: ${\displaystyle K_{d}'=K_{d}{\frac {1+[B]}{K_{b}}}}$
• Кооперативный аллостерический лиганд: ^{[ необходимо разъяснение ]} ${\displaystyle K_{d}'=K_{d}{\frac {K_{B}+[B]}{K_{B}+{\frac {[B]}{\alpha }}}}}$

Непреодолимое лекарство изменяет максимальное связывание:

• неконкурентное связывание: ${\displaystyle [R]'_{t}={\frac {[R]_{t}}{1+{\frac {[B]}{K_{b}}}}}}$
• необратимое связывание

Регрессия Шильда также может выявить наличие более одного типа рецепторов, а также может показать, был ли эксперимент проведен неправильно, поскольку система не достигла равновесия.

Анализы связывания радиолиганда

Первый радиорецепторный анализ (РРА) был проведен в 1970 году Лефковицем и др. ^{[ сомнительно – обсудить ]} с использованием радиоактивно меченого гормона для определения связывающей способности его рецептора. ^[1]

Радиорецепторный анализ требует отделения связанного лиганда от свободного. Это делается путем фильтрации , центрифугирования или диализа . ^[2]

Метод, не требующий разделения, — это сцинтилляционный анализ близости , который основан на том факте, что β-лучи от ³ H проходят чрезвычайно короткие расстояния. Рецепторы связаны с шариками, покрытыми полигидроксисцинтиллятором. Только связанные лиганды должны быть обнаружены.

Сегодня метод флуоресценции предпочтительнее радиоактивных материалов из-за гораздо более низкой стоимости, меньшей опасности и возможности мультиплексирования реакций с высокой пропускной способностью. Одна из проблем заключается в том, что лиганды с флуоресцентной меткой должны нести громоздкий флуорофор, который может затруднить связывание лиганда. Поэтому используемый флуорофор, длина линкера и его положение должны быть тщательно выбраны.

Примером может служить использование FRET , где флуорофор лиганда передает свою энергию флуорофору антитела, вырабатываемого против рецептора.

Другие методы обнаружения, такие как поверхностный плазмонный резонанс, даже не требуют флуорофоров.

Смотрите также

• Зависимость доза-реакция

Ссылки

1. Lefkowitz RJ, Roth J, Pastan I (ноябрь 1970 г.). «Радиорецепторный анализ адренокортикотропного гормона: новый подход к анализу полипептидных гормонов в плазме». Science . 170 (3958): 633–635. Bibcode :1970Sci...170..633L. doi :10.1126/science.170.3958.633. PMID  4319388. S2CID  41878471.
2. de Jong LA, Uges DR, Franke JP, Bischoff R (декабрь 2005 г.). «Анализы связывания рецептора с лигандом: технологии и приложения». Журнал хроматографии. B, Аналитические технологии в биомедицинских и биологических науках . 829 (1–2): 1–25. doi :10.1016/j.jchromb.2005.10.002. PMID  16253574.

Дальнейшее чтение

• Кенакин Т. (1993). Фармакологический анализ взаимодействия лекарств с рецепторами . Нью-Йорк: Raven Press.

Внешние ссылки

• curvefit.com — кривые зависимости реакции от дозы в присутствии антагонистов для наглядного объяснения.