Вирус Escherichia T4 — это вид бактериофагов , которые заражают бактерии Escherichia coli . Это двухцепочечный ДНК-вирус подсемейства Tevenvirinae семейства Straboviridae . T4 способен проходить только литический жизненный цикл , а не лизогенный жизненный цикл . Ранее этот вид назывался T-четным бактериофагом , это название также охватывает, среди прочих штаммов (или изолятов), фаг Enterobacteria T2 , фаг Enterobacteria T4 и фаг Enterobacteria T6 .
Начиная с 1940-х годов и по сей день, T-четные фаги считаются наиболее изученными модельными организмами. Модельные организмы обычно должны быть простыми, иметь не менее пяти генов . Тем не менее, T-четные фаги на самом деле являются одними из самых крупных и сложных вирусов , в которых генетическая информация этих фагов состоит из примерно 300 генов . В соответствии с их сложностью, было обнаружено, что T-четные вирусы имеют необычное основание гидроксиметилцитозин (HMC) вместо основания нуклеиновой кислоты цитозина . [4]
Геном двухцепочечной ДНК вируса T4 имеет длину около 169 кб [5] и кодирует 289 белков . Геном T4 терминально избыточн . При репликации ДНК образуются длинные многогеномные конкатемеры, возможно, с помощью механизма репликации по типу катящегося кольца. [6] При упаковке конкатемер разрезается в неспецифических положениях одинаковой длины, что приводит к образованию нескольких геномов, представляющих собой циклические перестановки исходного. [7] Геном T4 несет интронные последовательности, подобные эукариотам .
Последовательность Шайна-Дальгарно GAGG доминирует в ранних генах вируса T4, тогда как последовательность GGAG является мишенью для эндонуклеазы T4 RegB, которая инициирует раннюю деградацию мРНК. [8]
T4 — относительно большой вирус, шириной приблизительно 90 нм и длиной 200 нм (большинство вирусов имеют длину от 25 до 200 нм). Геном ДНК содержится в икосаэдрической головке, также известной как капсид . [9] Хвост T4 полый, поэтому он может передавать свою нуклеиновую кислоту в клетку, которую он заражает, после прикрепления. Фаги Myoviridae, такие как T4, имеют сложные сократительные хвостовые структуры с большим количеством белков, участвующих в сборке хвоста и его функционировании. [10] Волокна хвоста также важны для распознавания рецепторов поверхности клетки хозяина, поэтому они определяют, находится ли бактерия в пределах диапазона хозяина вируса. [11]
Структура 6-мегадальтонной базовой пластины T4, которая включает 127 полипептидных цепей 13 различных белков (продукты генов 5, 5.4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 25, 27, 48 и 53), недавно была описана в атомных деталях. Также была создана атомная модель проксимальной области хвостовой трубки, образованной gp54 и основным белком трубки gp19. Белок-лента gp29 присутствует в комплексах базовая пластина-хвостовая трубка, но его не удалось смоделировать. [12]
Во время сборки вириона бактериофага (фага) T4 морфогенетические белки, кодируемые генами фага , взаимодействуют друг с другом в характерной последовательности. Поддержание соответствующего баланса в количествах каждого из этих белков, продуцируемых во время вирусной инфекции, по-видимому, имеет решающее значение для нормального морфогенеза фага T4. [13] Кодируемые фагом T4 белки, которые определяют структуру вириона, включают основные структурные компоненты, второстепенные структурные компоненты и неструктурные белки, которые катализируют определенные этапы в последовательности морфогенеза. [14] Морфогенез фага T4 делится на три независимых пути: головка, хвост и длинные хвостовые волокна, как подробно описано Япом и Россманом. [15]
Вирус T4 инициирует инфекцию Escherichia coli , связывая белки порина OmpC и липополисахарид (ЛПС) на поверхности клеток E. coli с помощью своих длинных хвостовых волокон (LTF). [16] [17] Сигнал распознавания посылается через LTF к базовой пластинке. Это распутывает короткие хвостовые волокна (STF), которые необратимо связываются с поверхностью клетки E. coli . Базовая пластинка меняет конформацию, и оболочка хвоста сокращается, заставляя GP5 на конце хвостовой трубки прокалывать внешнюю мембрану клетки. [18] Домен лизоцима GP5 активируется и разрушает периплазматический пептидогликановый слой. Оставшаяся часть мембраны разрушается, и затем ДНК из головки вируса может пройти через хвостовую трубку и попасть в клетку E. coli . [ необходима цитата ]
В 1952 году Херши и Чейз [19] предоставили ключевые доказательства того, что ДНК фага, в отличие от белка, проникает в клетку бактерии-хозяина при инфицировании и, таким образом, является генетическим материалом фага. Это открытие предполагает, что ДНК, в общем, является генетическим материалом различных организмов. [ необходима цитата ]
Литический жизненный цикл (от проникновения в бактерию до ее разрушения) занимает приблизительно 30 минут (при 37 °C). Вирулентные бактериофаги размножаются в своем бактериальном хозяине сразу после проникновения. После того, как количество потомственных фагов достигает определенного количества, они заставляют хозяина лизироваться или разрушаться, поэтому они высвобождаются и заражают новые клетки хозяина. [20] Процесс лизиса и высвобождения хозяина называется литическим циклом . Литический цикл — это цикл вирусного размножения, который включает разрушение инфицированной клетки и ее мембраны. Этот цикл включает вирус, который захватывает клетку хозяина и ее механизмы для размножения. Поэтому вирус должен пройти 5 стадий, чтобы размножиться и заразить клетку хозяина: [ необходима цитата ]
После завершения жизненного цикла клетка-хозяин взрывается и выбрасывает вновь созданные вирусы в окружающую среду, разрушая клетку-хозяина. Размер взрыва T4 составляет приблизительно 100-150 вирусных частиц на одного инфицированного хозяина. [ необходима цитата ]
Бензер (1955 – 1959) разработал систему для изучения тонкой структуры гена с использованием мутантов бактериофага T4, дефектных в генах rIIA и rIIB . [21] [22] [23] Применяемые методы включали тесты на комплементацию и скрещивания для обнаружения рекомбинации , особенно между делеционными мутациями. Эти генетические эксперименты привели к обнаружению уникального линейного порядка мутационных участков внутри генов. Этот результат предоставил убедительные доказательства ключевой идеи о том, что ген имеет линейную структуру, эквивалентную длине ДНК со многими участками, которые могут независимо мутировать. [ необходима цитата ]
Как и все другие вирусы, Т-четные фаги не прикрепляются случайным образом к поверхности своего хозяина; вместо этого они «ищут» и связываются с рецепторами , определенными белковыми структурами, обнаруженными на поверхности хозяина. Эти рецепторы различаются в зависимости от фага; тейхоевая кислота , белки клеточной стенки и липополисахариды , жгутики и пили могут служить рецепторами для связывания фага. Для того чтобы Т-четный фаг заразил своего хозяина и начал свой жизненный цикл, он должен войти в первый процесс заражения , адсорбцию фага на бактериальной клетке. Адсорбция является ценной характеристикой пары фаг-хозяин, и адсорбция фага на поверхности клетки хозяина иллюстрируется как двухэтапный процесс: обратимый и необратимый. Он включает в себя структуру хвоста фага, которая начинается, когда волокна хвоста фага помогают связывать фаг с соответствующим рецептором его хозяина. Этот процесс обратим. Один или несколько компонентов базовой пластины опосредуют необратимый процесс связывания фага с бактерией. [ необходима цитата ]
Проникновение также является важной характеристикой инфекции фаг-хозяин , которая включает инъекцию генетического материала фагов внутрь бактерии . Проникновение нуклеиновой кислоты происходит после необратимой фазы адсорбции. Механизмы, включающие проникновение фаговой нуклеиновой кислоты, специфичны для каждого фага. Этот механизм проникновения может включать электрохимический мембранный потенциал, молекулы АТФ , ферментативное расщепление пептидогликанового слоя или все три этих фактора могут быть жизненно важными для проникновения нуклеиновой кислоты внутрь бактериальной клетки. Были проведены исследования механизма проникновения бактериофага Т2 (фаг типа Т4), и они показали, что хвост фага не проникает внутрь бактериальной клеточной стенки, а проникновение этого фага включает электрохимический мембранный потенциал на внутренней мембране. [24] [25]
Геном вируса T4 синтезируется в клетке-хозяине с помощью репликации по принципу катящегося кольца. [6] Время, необходимое для репликации ДНК в живой клетке, измерялось как скорость удлинения ДНК вируса T4 в инфицированной вирусом E. coli. [26] В период экспоненциального увеличения ДНК при 37 °C скорость составляла 749 нуклеотидов в секунду. Скорость мутаций на пару оснований на репликацию во время синтеза ДНК вируса T4 составляет 1,7 на 10−8 , [ 27] высокоточный механизм копирования ДНК, с всего 1 ошибкой на 300 копий. Вирус также кодирует уникальные механизмы репарации ДНК . [28] Головка фага T4 собирается пустой вокруг белка-каркаса, который позже деградирует. Следовательно, ДНК должна проникнуть в проголовку через крошечную пору, что достигается путем взаимодействия гексамера gp17 с ДНК в первую очередь, который также служит мотором и нуклеазой. Было обнаружено, что двигатель упаковки ДНК T4 загружает ДНК в вирусные капсиды со скоростью до 2000 пар оснований в секунду. Мощность, задействованная в этом процессе, если ее масштабировать, будет эквивалентна мощности среднего автомобильного двигателя. [29]
Последний этап вирусного размножения и размножения определяется высвобождением вирионов из клетки-хозяина. Высвобождение вирионов происходит после разрыва бактериальной плазматической мембраны. Безоболочечные вирусы лизируют клетку-хозяина, что характеризуется вирусными белками, атакующими пептидогликан или мембрану. Лизис бактерий происходит, когда капсиды внутри клетки высвобождают фермент лизоцим, который разрушает клеточную стенку. Освобожденные бактериофаги заражают другие клетки, и цикл размножения вируса повторяется внутри этих клеток. [ необходима цитата ]
Реактивация множественности (МР) — это процесс, посредством которого два или более вирусных генома, каждый из которых содержит инактивирующее повреждение генома, могут взаимодействовать внутри инфицированной клетки, образуя жизнеспособный вирусный геном. Сальвадор Лурия , изучая УФ-облученный вирус Т4 в 1946 году, открыл МР и предположил, что наблюдаемая реактивация поврежденного вируса происходит посредством механизма рекомбинации. (см. ссылки. [30] [31] [32] ) Это предшествовало подтверждению ДНК как генетического материала в 1952 году в родственном вирусе Т2 в эксперименте Херши–Чейза . [19]
Как вспоминает Лурия (1984, [33] стр. 97), открытие реактивации облученного вируса (называемое « реактивацией множественности ») немедленно вызвало всплеск активности в изучении восстановления радиационных повреждений в пределах ранней группы фагов (обзор Бернштейна [28] в 1981 году). Позже выяснилось, что восстановление поврежденного вируса путем взаимопомощи, которое открыл Лурия, было лишь одним частным случаем восстановления ДНК. Теперь известно, что клетки всех типов, не только бактерии и их вирусы, но и все изученные организмы, включая людей, имеют сложные биохимические процессы восстановления повреждений ДНК (см. Восстановление ДНК ). Процессы восстановления ДНК также теперь признаются играющими важнейшую роль в защите от старения , рака и бесплодия . [ необходима цитата ]
MR обычно представлен «кривыми выживания», где выживаемость способности к образованию бляшек многократно инфицированных клеток (мультикомплексов) отображается в зависимости от дозы повреждающего геном агента. Для сравнения выживаемость способности к образованию бляшек вируса однократно инфицированных клеток (монокомплексов) также отображается в зависимости от дозы повреждающего геном агента. На верхнем рисунке показаны кривые выживания мультикомплексов и монокомплексов вируса T4 при увеличении дозы УФ-излучения. Поскольку выживаемость отображается в логарифмическом масштабе, ясно, что выживаемость мультикомплексов превышает выживаемость монокомплексов в очень больших количествах (в зависимости от дозы). Кривая инактивации УФ-излучением для мультикомплексов имеет начальное плечо. Другими повреждающими ДНК вируса T4 агентами с плечами на их кривых выживания мультикомплексов являются рентгеновские лучи [34] [35] и этилметансульфонат (EMS). [28] Наличие плеча было интерпретировано как то, что используются два рекомбинационных процесса. [36] Первый путь восстанавливает ДНК с высокой эффективностью (в «плече»), но его способность насыщается по мере увеличения повреждения; второй путь функционирует на всех уровнях повреждения. Выживший вирус Т4, освобожденный из мультикомплексов, не показывает увеличения мутаций , что указывает на то, что MR вируса, облученного УФ-излучением, является точным процессом. [36]
На нижнем рисунке показаны кривые выживания для инактивации вируса T4 повреждающим ДНК агентом митомицином C (MMC). В этом случае кривая выживания для мультикомплексов не имеет начального плеча, что предполагает, что активен только второй процесс рекомбинационной репарации, описанный выше. Эффективность репарации этим процессом подтверждается наблюдением, что доза MMC, которая позволяет выжить только 1 из 1000 монокомплексов, позволяет выжить около 70% мультикомплексов. Аналогичные кривые выживания мультикомплексов (без плеч) были также получены для повреждающих ДНК агентов распада P32 , псоралена плюс облучение в ближнем УФ-диапазоне (PUVA), N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (MNNG), метилметансульфоната (MMS) и азотистой кислоты . [28]
Несколько генов, которые, как было установлено, необходимы для MR в вирусе T4, оказались ортологами генов, необходимых для рекомбинации в прокариотах , эукариотах и археях . К ним относится, например, ген T4 uvsX [37] , который определяет белок, имеющий трехмерную структурную гомологию с RecA из Escherichia coli и гомологичным белком RAD51 у эукариот и RadA у археев . Было высказано предположение, что эффективная и точная рекомбинационная репарация повреждений ДНК во время MR может быть аналогична процессу рекомбинационной репарации, который происходит во время мейоза у эукариот . [38]
Бактериофаги были впервые обнаружены английским ученым Фредериком Твортом в 1915 году и Феликсом д'Эреллем в 1917 году. В конце 1930-х годов Т. Л. Ракиетен предложил двум исследователям Милиславу Демерецу и Уго Фано либо смесь сырых сточных вод, либо лизат из E. coli, инфицированной сырыми сточными водами . Эти два исследователя выделили T3, T4, T5 и T6 из E. coli . Кроме того, в 1932 году исследователь Дж. Бронфенбреннер изучал и работал над фагом T2, в ходе которого фаг T2 был изолирован от вируса. [39] Эта изоляция была сделана из фекального материала, а не из сточных вод. В любом случае, Макс Дельбрюк был вовлечен в открытие четных фагов T. Его роль заключалась в том, чтобы назвать бактериофаги следующим образом: Тип 1 (Т1), Тип 2 (Т2), Тип 3 (Т3) и т. д. [ необходима цитата ]
Конкретное время и место выделения вируса Т4 остаются неясными, хотя они, вероятно, были обнаружены в сточных водах или фекальном материале. Т4 и подобные вирусы были описаны в статье Томаса Ф. Андерсона , Макса Дельбрюка и Милислава Демереца в ноябре 1944 года. [40] В 1943 году Сальвадор Лурия и Дельбрюк показали, что бактериальные мутации для устойчивости к фагам возникают при отсутствии отбора , а не являются ответом на отбор. [33] Традиционная мудрость среди бактериологов до 1943 года состояла в том, что у бактерий нет хромосом и генов. Эксперимент Лурии-Дельбрюка показал, что у бактерий, как и у других установленных модельных генетических организмов, есть гены, и что они могут спонтанно мутировать, создавая мутантов, которые затем могут размножаться, образуя клональные линии. В том же году они также начали работать с Альфредом Херши , другим экспериментатором с фагами. [41] (Эти трое разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1969 года «за работу над механизмом репликации и генетикой вирусов».)
Группа фагов была неформальной сетью биологов, центром которой был Макс Дельбрюк, который проводил фундаментальные исследования в основном на бактериофаге T4 и внес многочисленные основополагающие вклады в микробную генетику и истоки молекулярной биологии в середине 20-го века. В 1961 году Сидни Бреннер , один из первых членов группы фагов, сотрудничал с Фрэнсисом Криком , Лесли Барнеттом и Ричардом Уоттсом-Тобином в Кавендишской лаборатории в Кембридже для проведения генетических экспериментов, которые продемонстрировали основную природу генетического кода белков. [42] Эти эксперименты, проведенные с мутантами гена rIIB фага T4, показали, что для гена, кодирующего белок, три последовательных основания ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту белка. Таким образом, генетический код представляет собой триплетный код, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Они также получили доказательства того, что кодоны не перекрываются друг с другом в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что такая последовательность считывается с фиксированной начальной точки. [ необходима цитата ]
В 1962-1964 годах исследователи фага T4 предоставили возможность изучить функцию практически всех генов, которые необходимы для роста фага в лабораторных условиях. [43] [44] Эти исследования были облегчены открытием двух классов условных летальных мутантов . Один класс таких мутантов известен как янтарные мутанты . [45] Другой класс условных летальных мутантов называется температурно-чувствительными мутантами [46] Исследования этих двух классов мутантов привели к значительному пониманию многочисленных фундаментальных биологических проблем. Таким образом, было получено понимание функций и взаимодействий белков, используемых в механизмах репликации , репарации и рекомбинации ДНК , и того, как вирусы собираются из компонентов белка и нуклеиновой кислоты (молекулярный морфогенез ). Кроме того, была выяснена роль кодонов, завершающих цепь . В одном примечательном исследовании использовались янтарные мутанты, дефектные в гене, кодирующем основной головной белок фага T4. [47] Этот эксперимент предоставил весомые доказательства широко распространенной, но до 1964 года все еще недоказанной «гипотезы последовательности», что аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью гена, определяющего белок. Таким образом, это исследование продемонстрировало коллинеарность гена с кодируемым им белком.
Ряд лауреатов Нобелевской премии работали с вирусом T4 или вирусами, подобными T4, включая Макса Дельбрюка , Сальвадора Лурию , Альфреда Херши , Джеймса Д. Уотсона и Фрэнсиса Крика . Другие важные ученые, работавшие с вирусом T4, включают Майкла Россманна , Сеймура Бензера , Брюса Альбертса , Гизелу Мосиг , [48] Ричарда Ленски и Джеймса Булла .
Caudovirales
>
Myoviridae
>
Tevenvirinae
>
T4virus
>
Escherichia virus T4