stringtranslate.com

Фаг Т7

Структурная модель бактериофага T7 при атомном разрешении [1]

Бактериофаг T7 (или фаг T7 ) — это бактериофаг , вирус, который заражает бактерии. Он заражает большинство штаммов Escherichia coli и размножается на этих хозяевах. Бактериофаг T7 имеет литический жизненный цикл , что означает, что он разрушает клетку, которую он заражает. Он также обладает несколькими свойствами, которые делают его идеальным фагом для экспериментов: его очистка и концентрация дали последовательные значения в химических анализах; [2] его можно сделать неинфекционным под воздействием УФ-излучения; [3] и его можно использовать в фаговом дисплее для клонирования РНК-связывающих белков . [3]

Открытие

В исследовании 1945 года Демерека и Фано [4] T7 использовался для описания одного из семи типов фагов (T1–T7), которые растут литически на Escherichia coli . [5] Хотя все семь фагов были пронумерованы произвольно, позднее было обнаружено, что фаги с нечетными номерами, или T-нечетные фаги, имеют общие морфологические и биохимические особенности, которые отличают их от T-четных фагов. [6] До того, как его физически назвали T7, фаг использовался в предыдущих экспериментах. Немецко-американский биофизик Макс Дельбрюк работал с тем же вирусом в конце 1930-х годов, назвав его фагом δ, а франко-канадский микробиолог Феликс д'Эрелль, вероятно, изучал его близкого родственника в 1920-х годах. [7] [5]

Хозяева

T7 растет на шероховатых штаммах Escherichia coli (т. е. тех, на поверхности которых отсутствует полноразмерный полисахарид О-антигена ) и некоторых других кишечных бактериях , но близкие родственники также заражают гладкие и даже капсулированные штаммы. [8]

Структура вириона

Цветная микрофотография вириона T7 с шестью хвостовыми волокнами, которые отогнуты назад к капсиду. Волокна удлиняются, когда вирус находит подходящего хозяина.
Аннотированный схематический рисунок вириона фага Enterobacteria T7 (поперечное сечение и вид сбоку)

Вирус имеет сложную структурную симметрию, с капсидом фага, который является икосаэдрическим (двадцать граней) с внутренним диаметром 55  нм и хвостом диаметром 19 нм и длиной 28,5 нм, прикрепленным к капсиду. [9] Выброс белков из капсида при инфицировании заставляет вирус изменять структуру, когда он проникает в клетку. [10]

Геном

Геном фага T7 [11] был одним из первых полностью секвенированных геномов и был опубликован в 1983 году. [ 12] Головка фаговой частицы содержит геном dsDNA размером около 40 кб , который кодирует 55 белков. [13] Геном содержит многочисленные перекрывающиеся гены [14] , которые были частично удалены посредством «рефакторинга» генома для получения T7.1. [15]

Схематическое изображение генома фага T7. Ящики — это гены, числа — это номера генов. Цвета обозначают функциональные группы, как показано. Белые ящики — это гены с неизвестной функцией или без аннотации. Изменено после [5]

Жизненный цикл

Жизненный цикл T7 составляет 17 мин при 37˚C, то есть время от заражения до лизиса клетки-хозяина, когда высвобождаются новые фаги. Из-за короткого латентного периода большинство физиологических исследований проводятся при 30˚C, где инфицированные клетки лизируются через 30 мин. Однако были выделены штаммы T7 с высокой приспособленностью, у которых латентный период составляет всего ~11 мин при 37˚C, растущих в оптимальных условиях в богатых средах. Этот адаптированный фаг может подвергаться эффективному расширению своей популяции более чем на 1013 за один час роста. [16]

Инфицирование бактерий-хозяев

T7 заражает клетку-хозяина . Схематический рисунок с аннотациями.
Томограммы вириона T7 в действии. T7 использует свои волокна, чтобы «пройтись» по поверхности клетки и в конечном итоге заразить ее.
Цикл размножения Т7, всего
Репликационная машина Т7, детали

Фаг T7 распознает определенные рецепторы на поверхности клеток E. coli и связывается с поверхностью клетки с помощью своих вирусных хвостовых волокон. В некоторых штаммах T7 хвостовые волокна заменены на шипы, которые разрушают O- или K-антигены на поверхности клетки посредством ферментативной активности . [5]

Процесс адсорбции и проникновения использует лизоцимы для создания отверстия в пептидогликановом слое стенки бактериальной клетки, что позволяет переносить вирусную ДНК в бактерию. Короткий, обрубленный хвост фага типа T7 слишком короток, чтобы охватить клеточную оболочку, и для того, чтобы выбросить геном фага в клетку при инициации инфекции, белки вириона должны сначала создать канал от кончика хвоста в цитоплазму клетки. [17] Фаг также высвобождает пять белков, необходимых для начала репликации вирусного генома и расщепления генома хозяина. [18] Бактериофаг T7 был эволюционно изменен, чтобы преодолеть несколько защитных механизмов бактерии-хозяина, включая пептидогликановую клеточную стенку и систему CRISPR . [18] Как только фаг T7 вставил вирусный геном, процесс репликации ДНК генома хозяина останавливается и начинается репликация вирусного генома. [19]

При оптимальных условиях фаг T7 может завершить литический процесс в течение 25 минут, что приводит к гибели клетки-хозяина E. coli . В момент лизиса вирус может произвести более 100 потомков. [18]

Компоненты

Gp5 (кодируется геном gp5 ) — это ДНК-полимераза T7 . ДНК-полимераза T7 использует эндогенный тиоредоксин E. coli , REDOX-белок, в качестве скользящего зажима ДНК во время репликации ДНК фага (хотя тиоредоксин обычно имеет другую функцию). Скользящий зажим удерживает полимеразу на ДНК, что увеличивает скорость синтеза. [20]

Репликация и репарация ДНК

Фаг T7 имеет самую простую из известных ДНК- реплисом , состоящую из геликазы и праймазы , которые находятся в одной полипептидной цепи, которая образует гексамер в присутствии ДНК и АТФ или dTTP . ДНК-полимераза T7, при содействии тиоредоксина E. coli , осуществляет синтез как ведущей, так и отстающей цепи ДНК .

В фаге T7 двухцепочечные разрывы ДНК, вероятно, восстанавливаются путем вставки участка донорской ДНК в зазор в месте разрыва. [21] Это восстановление двухцепочечных разрывов облегчается геном белка 2.5, который способствует отжигу гомологичных комплементарных цепей ДНК . [22]

Репликативные промежуточные продукты

Реплицирующаяся внутриклеточная ДНК фага T7, растянутая после лизиса клеток, обычно длиннее зрелой хромосомы фага (от 11 до 15 мкМ) и может встречаться в форме сильно сцепленных линейных цепей, длина которых до 66 раз превышает длину зрелой хромосомы фага. [23] Реплицирующаяся ДНК также может быть видна в форме скрученных кольцевых структур, которые, по-видимому, соответствуют многопетлевым конфигурациям ДНК, в которых сверхспиральные изгибы, необходимые для уплотнения ДНК, были ослаблены за счет надреза цепей при лизисе клеток. [23]

Применение в молекулярной биологии

Последовательность промотора T7 широко используется в молекулярной биологии из-за ее чрезвычайно высокого сродства к РНК-полимеразе T7 и, следовательно, высокого уровня экспрессии. [3] [2]

T7 использовался в качестве модели в синтетической биологии . Чан и др. (2005) « рефакторили » геном T7, заменив приблизительно 12 кб его генома сконструированной ДНК. [15] Сконструированная ДНК была разработана таким образом, чтобы с ней было легче работать несколькими способами: отдельные функциональные элементы были разделены сайтами рестриктазы для простой модификации, а перекрывающиеся домены кодирования белков были разделены и, при необходимости, модифицированы с помощью молчащих мутаций одной пары оснований .

Ссылки

  1. ^ Падилла-Санчес, Виктор (2021-07-10), Структурная модель бактериофага T7 при атомном разрешении, doi :10.5281/zenodo.5133295 , получено 2021-07-24
  2. ^ ab Studier, F. William (1969-11-01). "Генетика и физиология бактериофага T7". Вирусология . 39 (3): 562–574. doi :10.1016/0042-6822(69)90104-4. ISSN  0042-6822. PMID  4902069.
  3. ^ abc Теэсалу, Тамбет; Сугахара, Кадзуки Н.; Руослахти, Эркки (1 января 2012 г.). «Картирование сосудистых почтовых индексов с помощью фагового дисплея». В Витрупе, К. Дейн; Вердин, Грегори Л. (ред.). Методы энзимологии . Том. 503. Академик Пресс. стр. 35–56. дои : 10.1016/B978-0-12-396962-0.00002-1. ISBN 978-0-12-396962-0. PMID  22230564.
  4. ^ Демерек, М; Фано, У (15 марта 1945 г.). «Мутанты, устойчивые к бактериофагам в Escherichia coli». Генетика . 30 (2): 119–136. doi :10.1093/genetics/30.2.119. PMC 1209279. PMID 17247150  . 
  5. ^ abcd Хойзер, Роман; Блаше, Соня; Докланд, Терье; Хаггорд-Люнгквист, Элизабет; фон Брунн, Альбрехт; Салас, Маргарита; Касьенс, Шервуд; Молино, Ян; Утц, Питер (2012). «Белко-белковые взаимодействия бактериофагов». Достижения в области исследования вирусов . 83 : 219–298. дои : 10.1016/B978-0-12-394438-2.00006-2. ISBN 978-0-12-394438-2. PMC  3461333 . PMID  22748812.
  6. ^ Кэммак, Ричард; Этвуд, Тереза; Кэмпбелл, Питер; Пэриш, Ховард; Смит, Энтони; Велла, Фрэнк; Стирлинг, Джон, ред. (2006). Оксфордский словарь биохимии и молекулярной биологии. Oxford University Press. doi :10.1093/acref/9780198529170.001.0001. ISBN 9780191727641.
  7. ^ Д'Эрелль, Феликс (1926). Бактериофаг и его поведение. Балтимор, Мэриленд: Williams & Wilkins. doi :10.5962/bhl.title.7308. LCCN  26009494. OCLC  2394374.
  8. ^ Molineux, Ian J. (2006). "Глава 20: Группа T7". В Calendar, Richard Lane (ред.). Бактериофаги (2-е изд.). Oxford: Oxford University Press. стр. 277. ISBN 9780195148503.
  9. ^ "Teseptimavirus ~ ViralZone page". viruszone.expasy.org . Получено 18 ноября 2019 г. .
  10. ^ Molineux, Ian J.; Panja, Debabrata (март 2013 г.). «Выталкивание пробки: механизмы выброса генома фага». Nature Reviews Microbiology . 11 (3): 194–204. doi :10.1038/nrmicro2988. ISSN  1740-1534. PMID  23385786. S2CID  205498472.
  11. ^ "Геном бактериофага Т7". 9 сентября 2004 г. Получено 18 мая 2011 г.
  12. ^ Данн, Джон Дж.; Стадиер, Ф. Уильям; Готтесман, М. (июнь 1983 г.). «Полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага Т7 и расположение генетических элементов Т7». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 477–535. doi :10.1016/S0022-2836(83)80282-4. PMID  6864790.
  13. ^ "Uniprot: референтный протеом бактериофага T7".
  14. ^ Райт, Брэдли У.; Моллой, Марк П.; Яшке, Пол Р. (5 октября 2021 г.). «Перекрывающиеся гены в естественных и сконструированных геномах». Nature Reviews Genetics . 23 (3): 154–168. doi :10.1038/s41576-021-00417-w. ISSN  1471-0064. PMC 8490965. PMID 34611352  . 
  15. ^ ab Chan, Leon Y; Kosuri, Sriram; Endy, Drew (январь 2005 г.). "Рефакторинг бактериофага T7". Молекулярная системная биология . 1 (1): 2005.0018. doi :10.1038/msb4100025. PMC 1681472. PMID  16729053 . 
  16. ^ Хайнеман, Ричард Х.; Булл, Джеймс Дж. (июль 2007 г.). «Проверка оптимальности с помощью экспериментальной эволюции: время лизиса в бактериофаге». Эволюция . 61 (7): 1695–1709. doi :10.1111/j.1558-5646.2007.00132.x. PMC 1974807. PMID  17598749. 
  17. ^ Чанг, Чунг-Ю; Кемп, Присцилла; Молино, Ян Дж. (март 2010 г.). «Gp15 и gp16 взаимодействуют при транслокации ДНК бактериофага T7 в инфицированную клетку». Вирусология . 398 (2): 176–186. doi :10.1016/j.virol.2009.12.002. PMC 2825023. PMID  20036409 . 
  18. ^ abc Qimron, Udi; Tabor, Stanley; Richardson, Charles C. "Новые подробности о взаимодействиях бактериофага T7 с хозяином". Архивировано из оригинала 17 августа 2011 г.
  19. ^ Кульчик, AW; Ричардсон, CC (2016). «Система репликации бактериофага T7». Ферменты . 39 : 89–136. doi :10.1016/bs.enz.2016.02.001. ISBN 978-0-12-804735-4. PMID  27241928.
  20. ^ Джеффри, Констанс Дж. (январь 1999). «Подрабатывающие белки». Тенденции в биохимических науках . 24 (1): 8–11. doi :10.1016/S0968-0004(98)01335-8. ISSN  0968-0004. PMID  10087914.
  21. ^ Лай, Ин-Та; Маскер, Уоррен (апрель 2000 г.). «Репарация двухцепочечных разрывов путем включения молекулы гомологичной ДНК». Молекулярная микробиология . 36 (2): 437–446. дои : 10.1046/j.1365-2958.2000.01861.x. ПМИД  10792729.
  22. ^ Ю, Ман; Маскер, Уоррен (15 марта 2001 г.). «Для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК необходим белок связывания одноцепочечной ДНК T7, но не геликаза T7». Журнал бактериологии . 183 (6): 1862–1869. doi : 10.1128 /JB.183.6.1862-1869.2001. PMC 95080. PMID  11222583. 
  23. ^ ab Бернстайн, Кэрол; Бернстайн, Харрис (июнь 1974 г.). «Спиральные кольца ДНК, высвобождаемые из клеток, инфицированных бактериофагами T7 или T4, или из неинфицированных Escherichia coli». Журнал вирусологии . 13 (6): 1346–1355. doi :10.1128/JVI.13.6.1346-1355.1974. PMC 355455. PMID  4598784 . 

Внешние ссылки