Флуоресцентная корреляционная спектроскопия

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия ( ФКС ) представляет собой статистический анализ стационарных флуктуаций интенсивности флуоресценции посредством временной корреляции . Ее теоретическая основа возникла из гипотезы регрессии Л. Онзагера . Анализ обеспечивает кинетические параметры физических процессов, лежащих в основе флуктуаций. Одним из интересных приложений этого является анализ флуктуаций концентрации флуоресцентных частиц (молекул) в растворе. В этом приложении наблюдается флуоресценция, испускаемая из очень маленького пространства в растворе, содержащем небольшое количество флуоресцентных частиц (молекул). Интенсивность флуоресценции колеблется из-за броуновского движения частиц. Другими словами, количество частиц в подпространстве, определяемом оптической системой, случайным образом меняется вокруг среднего числа. Анализ дает среднее количество флуоресцентных частиц и среднее время диффузии, когда частица проходит через пространство. В конечном итоге определяются как концентрация, так и размер частицы (молекулы). Оба параметра важны в биохимических исследованиях, биофизике и химии.

FCS является таким чувствительным аналитическим инструментом, поскольку он наблюдает небольшое количество молекул (от наномолярных до пикомолярных концентраций) в небольшом объеме (~1 мкм ³ ). ^[1] В отличие от других методов (таких как анализ ВЭЖХ ) FCS не имеет физического процесса разделения; вместо этого он достигает своего пространственного разрешения с помощью своей оптики. Кроме того, FCS позволяет наблюдать молекулы с флуоресцентной меткой в ​​биохимическом пути в неповрежденных живых клетках. ^[2] Это открывает новую область, «биохимию in situ или in vivo»: отслеживание биохимического пути в неповрежденных клетках и органах. ^[3]

Обычно FCS используется в контексте оптической микроскопии , в частности конфокальной микроскопии или микроскопии двухфотонного возбуждения . В этих методах свет фокусируется на образце, а измеренные флуктуации интенсивности флуоресценции (вследствие диффузии , физических или химических реакций, агрегации и т. д.) анализируются с использованием временной автокорреляции. Поскольку измеряемое свойство по существу связано с величиной и/или количеством флуктуаций, существует оптимальный режим измерения на уровне, когда отдельные виды входят или выходят из объема наблюдения (или включаются и выключаются в объеме). Когда слишком много объектов измеряются одновременно, общие флуктуации малы по сравнению с общим сигналом и могут быть неразрешимыми — в другом направлении, если отдельные события флуктуации слишком разрежены во времени, одно измерение может занять непозволительно много времени. FCS в некотором роде является флуоресцентным аналогом динамического рассеяния света , которое использует когерентное рассеяние света вместо (некогерентной) флуоресценции.

Если известна соответствующая модель, FCS можно использовать для получения количественной информации, такой как

• коэффициенты диффузии
• гидродинамические радиусы
• средние концентрации
• кинетические скорости химических реакций
• синглет-триплетная динамика

Поскольку флуоресцентные маркеры бывают разных цветов и могут быть специфически связаны с определенной молекулой (например, белками, полимерами, металлокомплексами и т. д.), можно изучать поведение отдельных молекул (в быстрой последовательности в композитных растворах). С развитием чувствительных детекторов, таких как лавинные фотодиоды, обнаружение сигнала флуоресценции, исходящего от отдельных молекул в сильно разбавленных образцах, стало практичным. С этим появилась возможность проводить эксперименты FCS на самых разных образцах, от материаловедения до биологии. Появление сконструированных клеток с генетически помеченными белками (например, зеленым флуоресцентным белком ) сделало FCS распространенным инструментом для изучения молекулярной динамики в живых клетках. ^[4]

История

Методы корреляции сигналов были впервые экспериментально применены к флуоресценции в 1972 году Магде, Элсоном и Уэббом ^[5] , которых поэтому обычно считают изобретателями FCS. Метод был дополнительно разработан в группе статей этих и других авторов вскоре после этого, установив теоретические основы и типы приложений. ^{[6] [7] [8]} Около 1990 года, с возможностью обнаружения достаточно малого количества флуоресцентных частиц, возникли две проблемы: негауссово распределение интенсивности флуоресценции и трехмерный конфокальный объем измерения лазерной микроскопической системы. ^[9] Первое привело к анализу распределений и моментов флуоресцентных сигналов для извлечения молекулярной информации, ^{[10] [11],} что в конечном итоге стало набором методов, известных как анализ яркости. См. Томпсон (1991) ^[12] для обзора того периода.

Начиная с 1993 года ^[13] ряд усовершенствований в методах измерения — в частности, использование конфокальной микроскопии, а затем двухфотонной микроскопии — для лучшего определения объема измерения и отбрасывания фона — значительно улучшили соотношение сигнал/шум и позволили повысить чувствительность к отдельным молекулам. ^{[14] [15]} С тех пор интерес к FCS возобновился, и по состоянию на август 2007 года в Web of Science было найдено более 3000 статей с использованием FCS. См. обзор Кричевского и Бонне ^[16] . Кроме того, наблюдался всплеск активности по расширению FCS различными способами, например, до лазерного сканирования и конфокальной микроскопии с вращающимся диском (из стационарного измерения в одной точке), использования кросс-корреляции (FCCS) между двумя флуоресцентными каналами вместо автокорреляции и использования резонансного переноса энергии по Фёрстеру (FRET) вместо флуоресценции.

Типичная установка

Принципиальная схема прибора флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Типичная установка FCS состоит из лазерной линии (длины волн обычно варьируются от 405 до 633 нм ( непрерывный ) и от 690 до 1100 нм (импульсный)), которая отражается в объектив микроскопа дихроичным зеркалом. Лазерный луч фокусируется в образце, который содержит флуоресцентные частицы (молекулы) в таком высоком разбавлении, что только несколько из них находятся в фокусном пятне (обычно 1–100 молекул в одном фл). Когда частицы пересекают фокусный объем, они флуоресцируют. Этот свет собирается тем же объективом и, поскольку он смещен в красную сторону относительно возбуждающего света, он проходит через дихроичное зеркало, достигая детектора, обычно фотоумножительной трубки, лавинного фотодиодного детектора или сверхпроводящего нанопроводного однофотонного детектора . Результирующий электронный сигнал может быть сохранен либо непосредственно в виде зависимости интенсивности от времени для анализа в более поздней точке, либо вычислен для непосредственного создания автокорреляции ( для чего требуются специальные карты сбора данных). Кривая FCS сама по себе представляет только временной спектр. Выводы о физических явлениях должны быть извлечены оттуда с помощью соответствующих моделей. Интересующие параметры находятся после подгонки автокорреляционной кривой к смоделированным функциональным формам. ^[17]

Объем измерения

Объем измерения представляет собой свертку геометрий освещения (возбуждения) и обнаружения, которые являются результатом задействованных оптических элементов. Результирующий объем математически описывается функцией рассеяния точки (или PSF), по сути это изображение точечного источника. PSF часто описывается как эллипсоид (с нерезкими границами) диаметром фокуса в несколько сотен нанометров и почти одним микрометром вдоль оптической оси. Форма значительно варьируется (и оказывает большое влияние на результирующие кривые FCS) в зависимости от качества оптических элементов (крайне важно избегать астигматизма и проверять реальную форму PSF на приборе). В случае конфокальной микроскопии и для небольших отверстий (около одной единицы Эйри) PSF хорошо аппроксимируется гауссовыми функциями:

${\displaystyle PSF(r,z)=I_{0}e^{-2r^{2}/\omega _{xy}^{2}}e^{-2z^{2}/\omega _{z}^{2}}}$

где — пиковая интенсивность, r и z — радиальное и аксиальное положение, а и — радиальный и аксиальный радиусы, и . Эта гауссова форма предполагается при выводе функциональной формы автокорреляции. ${\displaystyle I_{0}}$ ${\displaystyle \omega _{xy}}$ ${\displaystyle \omega _{z}}$ ${\displaystyle \omega _{z}>\omega _{xy}}$

Обычно составляет 200–300 нм и в 2–6 раз больше. ^[18] Одним из распространенных способов калибровки параметров объема измерения является выполнение FCS на образцах с известным коэффициентом диффузии и концентрацией (см. ниже). Коэффициенты диффузии для распространенных флуорофоров в воде приведены в следующем разделе. ${\displaystyle \omega _{xy}}$ ${\displaystyle \omega _{z}}$

Гауссово приближение работает в разной степени в зависимости от оптических деталей, и иногда можно применять поправки для компенсации ошибок в приближении. ^[19]

Функция автокорреляции

Необработанные данные FCS и коррелированные данные.

(Временная) автокорреляционная функция — это корреляция временного ряда с самим собой, сдвинутая по времени , как функция : ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {\langle \delta I(t)\delta I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}={\frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}-1}$

где — отклонение от средней интенсивности. Нормализация (знаменатель) здесь наиболее часто используется для FCS, поскольку тогда корреляция при , G (0), связана со средним числом частиц в объеме измерения. ${\displaystyle \delta I(t)=I(t)-\langle I(t)\rangle }$ ${\displaystyle \tau =0}$

В качестве примера на рисунке справа показаны необработанные данные FCS и их автокорреляция для свободно диффундирующего родамина 6G. График сверху показывает интенсивность флуоресценции в зависимости от времени. Интенсивность колеблется по мере того, как родамин 6G входит и выходит из фокального объема. На нижнем графике показана автокорреляция тех же данных. Информацию о скорости диффузии и концентрации можно получить с помощью одной из моделей, описанных ниже.

Для гауссова профиля освещения автокорреляционная функция задается общей основной формулой ^[20] ${\displaystyle PSF(r,z)}$

${\displaystyle G(\tau )={\frac {1}{\langle N\rangle }}\left\langle \exp \left(-{\frac {\Delta X(\tau )^{2}+\Delta Y(\tau )^{2}}{w_{xy}^{2}}}-{\frac {\Delta Z(\tau )^{2}}{w_{z}^{2}}}\right)\right\rangle ,}$

где вектор обозначает стохастическое смещение в пространстве флуорофора после времени . Выражение справедливо, если среднее число флуорофоров в фокальном объеме мало и если темные состояния и т. д. флуорофора можно игнорировать. В частности, не было сделано никаких предположений о типе исследуемого диффузионного движения. Формула допускает интерпретацию как (i) вероятность возврата для малых параметров пучка и (ii) функцию генерации момента , если изменяются. ${\displaystyle \Delta {\vec {R}}(\tau )=(\Delta X(\tau ),\Delta Y(\tau ),\Delta Z(\tau ))}$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \langle N\rangle }$ ${\displaystyle G(\tau )}$ ${\displaystyle w_{xy},w_{z}}$ ${\displaystyle |\Delta {\vec {R}}(\tau )|^{2}}$ ${\displaystyle w_{xy},w_{z}}$

Интерпретация функции автокорреляции

Для извлечения интересующих величин данные автокорреляции могут быть подогнаны, как правило, с использованием нелинейного алгоритма наименьших квадратов . Функциональная форма подгонки зависит от типа динамики (и рассматриваемой оптической геометрии).

Нормальная диффузия

Коррелированные данные и модель нормальной диффузии

Флуоресцентные частицы, используемые в FCS, малы и, таким образом, испытывают тепловые движения в растворе. Простейший эксперимент FCS, таким образом, представляет собой обычную трехмерную диффузию, для которой автокорреляция имеет вид:

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

где — отношение осевого радиуса к радиальному радиусу измерительного объема, а — характерное время пребывания. Эта форма была получена с учетом гауссовского измерительного объема. Обычно подгонка имеет три свободных параметра — G(0), и — из которых можно получить коэффициент диффузии и концентрацию флуорофора. ${\displaystyle a=\omega _{z}/\omega _{xy}}$ ${\displaystyle e^{-2}}$ ${\displaystyle \tau _{D}}$ ${\displaystyle G(\infty )}$ ${\displaystyle \tau _{D}}$

При нормировке, использованной в предыдущем разделе, G (0) дает среднее число диффузоров в объеме <N> или, что эквивалентно — при знании размера объема наблюдения — среднюю концентрацию:

${\displaystyle \ G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}={\frac {1}{V_{\text{eff}}\langle C\rangle }},}$

где эффективный объем находится путем интегрирования гауссовой формы объема измерения и определяется по формуле:

${\displaystyle \ V_{\text{eff}}=\pi ^{3/2}\omega _{xy}^{2}\omega _{z}.\,}$

D дает коэффициент диффузии:

${\displaystyle \ D=\omega _{xy}^{2}/{4\tau _{D}}.}$

Аномальная диффузия

Если диффундирующие частицы сдерживаются препятствиями или подталкиваются силой (молекулярными двигателями, потоком и т. д.), динамика часто недостаточно хорошо описывается моделью нормальной диффузии, где среднеквадратичное смещение (СКС) растет линейно со временем. Вместо этого диффузию можно лучше описать как аномальную диффузию , где временная зависимость СКС нелинейна, как в степенном законе:

${\displaystyle \ MSD=6D_{a}t^{\alpha }\,}$

где — аномальный коэффициент диффузии. «Аномальная диффузия» обычно относится только к этой очень общей модели, а не ко многим другим возможностям, которые можно было бы описать как аномальные. Кроме того, степенной закон, в строгом смысле, является ожидаемой формой только для узкого диапазона строго определенных систем, например, когда распределение препятствий является фрактальным . Тем не менее, степенной закон может быть полезным приближением для более широкого диапазона систем. ${\displaystyle D_{a}}$

Функция автокорреляции FCS для аномальной диффузии имеет вид:

${\displaystyle G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D})^{\alpha })(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D})^{\alpha })^{1/2}}}+G(\infty ),}$

где аномальный показатель степени такой же, как и выше, и становится свободным параметром при подгонке. ${\displaystyle \alpha }$

С помощью FCS было показано, что аномальный показатель степени является показателем степени молекулярной скученности (он меньше единицы и тем меньше, чем выше степень скученности). ^[21]

Полидисперсная диффузия

Если имеются диффундирующие частицы с разными размерами (коэффициентами диффузии), то обычно подгоняют под функцию, которая представляет собой сумму однокомпонентных форм:

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\sum _{i}{\frac {\alpha _{i}}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )}$

где сумма берется по числу различных размеров частиц, индексированных i, и дает вес, который связан с квантовым выходом и концентрацией каждого типа. Это вводит новые параметры, что делает подгонку более сложной, поскольку необходимо искать в пространстве более высокой размерности. Нелинейная подгонка наименьших квадратов обычно становится нестабильной даже при небольшом количестве s. Более надежной схемой подгонки, особенно полезной для полидисперсных образцов, является метод максимальной энтропии. ^[22] ${\displaystyle \alpha _{i}}$ ${\displaystyle \tau _{D,i}}$

Диффузия с потоком

При диффузии вместе с равномерным потоком со скоростью в боковом направлении автокорреляция имеет вид: ^[23] ${\displaystyle v}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}\times \exp[-(\tau /\tau _{v})^{2}\times {\frac {1}{1+\tau /\tau _{D}}}]+G(\infty )}$

где - среднее время пребывания, если есть только поток (без диффузии). ${\displaystyle \tau _{v}=\omega _{xy}/v}$

Химическая релаксация

Широкий спектр возможных экспериментов FCS включает химические реакции, которые постоянно колеблются от равновесия из-за тепловых движений (и затем «расслабляются»). В отличие от диффузии, которая также является процессом релаксации, флуктуации вызывают изменения между состояниями с различными энергиями. Одной из очень простых систем, демонстрирующих химическую релаксацию, будет стационарный участок связывания в измерительном объеме, где частицы производят сигнал только при связывании (например, с помощью FRET или если время диффузии намного меньше интервала выборки). В этом случае автокорреляция имеет вид:

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0)\exp(-\tau /\tau _{B})+G(\infty )}$

где

${\displaystyle \ \tau _{B}=(k_{\text{on}}+k_{\text{off}})^{-1}}$

— время релаксации, зависящее от кинетики реакции (скорости включения и выключения), а также:

${\displaystyle G(0)={\frac {1}{\langle N\rangle }}{\frac {k_{on}}{k_{off}}}={\frac {1}{\langle N\rangle }}K}$

связана с константой равновесия K.

Большинство систем с химической релаксацией также показывают измеримую диффузию, и функция автокорреляции будет зависеть от деталей системы. Если диффузия и химическая реакция разделены, объединенная автокорреляция является продуктом химической и диффузионной автокорреляций.

Коррекция триплетного состояния

Автокорреляции выше предполагают, что флуктуации не вызваны изменениями флуоресцентных свойств частиц. Однако для большинства (био)органических флуорофоров — например, зеленого флуоресцентного белка , родамина, красителей Cy3 и Alexa Fluor — некоторая часть освещенных частиц возбуждается до триплетного состояния (или других нерадиационных распадающихся состояний) и затем не испускает фотоны в течение характерного времени релаксации . Обычно составляет порядка микросекунд, что обычно меньше интересующей динамики (например, ), но достаточно велико для измерения. Мультипликативный член добавляется к автокорреляции для учета триплетного состояния. Для нормальной диффузии: ${\displaystyle \tau _{F}}$ ${\displaystyle \tau _{F}}$ ${\displaystyle \tau _{D}}$

${\displaystyle \ G(\tau )=G(0){\frac {(1-F+Fe^{-\tau /\tau _{F}})}{(1-F)}}{\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty )}$^[24]

где — доля частиц, которые вошли в триплетное состояние, а — соответствующее время релаксации триплетного состояния. Если интересующая нас динамика намного медленнее релаксации триплетного состояния, кратковременный компонент автокорреляции можно просто усечь, и триплетный член станет ненужным. ${\displaystyle \ F}$ ${\displaystyle \ \tau _{F}}$

Обычные флуоресцентные зонды

Флуоресцентный вид, используемый в FCS, обычно представляет собой интересующую биомолекулу, которая была помечена флуорофором (например, с помощью иммуногистохимии ), или является голым флуорофором, который используется для зондирования некоторой интересующей среды (например, цитоскелета клетки). В следующей таблице приведены коэффициенты диффузии некоторых распространенных флуорофоров в воде при комнатной температуре и их длины волн возбуждения.

Вариации

FCS почти всегда относится к одноточечному, одноканальному, временному автокорреляционному измерению, хотя термин «флуоресцентная корреляционная спектроскопия» вне своего исторического научного контекста не подразумевает такого ограничения. FCS был расширен в ряде вариаций разными исследователями, причем каждое расширение порождало другое название (обычно аббревиатуру).

Спектроскопия корреляции флуоресценции с вариацией пятен (svFCS)

В то время как FCS — это точечное измерение, обеспечивающее время диффузии при заданном объеме наблюдения, svFCS — это метод, в котором пятно наблюдения варьируется для измерения времени диффузии при разных размерах пятна. Зависимость между временем диффузии и площадью пятна линейна и может быть построена для того, чтобы расшифровать основной вклад ограничения. Полученная кривая называется законом диффузии. Этот метод используется в биологии для изучения организации плазматической мембраны на живых клетках.

${\displaystyle \ \omega _{xy}^{2}=4D\tau _{D}+t_{0}}$

где - ось ординат. В случае броуновской диффузии, . В случае ограничения, вызванного изолированными доменами, тогда как в случае изолированных доменов, . ${\displaystyle t_{0}}$ ${\displaystyle t_{0}=0}$ ${\displaystyle t_{0}>0}$ ${\displaystyle t_{0}<0}$

Исследования svFCS на живых клетках и работы по моделированию ^{[32] [33] [34] [35] [36]}

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия с контролируемым объемом выборки (SVC-FCS): ^[37]

z-сканирование FCS ^[38]

FCS с наноапертурами: преодоление дифракционного барьера ^[39]

STED-FCS: ^[40]

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (ФККС)

FCS иногда используется для изучения молекулярных взаимодействий с использованием различий во времени диффузии (например, продукт реакции ассоциации будет больше и, следовательно, иметь большее время диффузии, чем реагенты по отдельности); однако FCS относительно нечувствителен к молекулярной массе, как можно видеть из следующего уравнения, связывающего молекулярную массу со временем диффузии глобулярных частиц (например, белков):

${\displaystyle \ \tau _{D}={\frac {3\pi \omega _{xy}^{2}\eta }{2kT}}(M)^{1/3}}$

где — вязкость образца, а — молекулярная масса флуоресцентного вещества. На практике время диффузии должно существенно отличаться — по крайней мере в 1,6 раза, что означает, что молекулярные массы должны отличаться в 4 раза. ^[41] Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) измеряет взаимодействия путем кросс-корреляции двух или более флуоресцентных каналов (по одному каналу для каждого реагента), что позволяет различать взаимодействия более чувствительно, чем FCS, особенно когда изменение массы в реакции мало. ${\displaystyle \ \eta }$ ${\displaystyle \ M}$

Методы анализа яркости

Этот набор методов включает число и яркость (N&B), ^[42] гистограмму подсчета фотонов (PCH), ^[43] анализ распределения интенсивности флуоресценции (FIDA), ^[44] и кумулянтный анализ. ^[45] и анализ пространственного распределения интенсивности. ^[46] Также сообщается о сочетании нескольких методов. ^[47] Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия преодолевает слабую зависимость скорости диффузии от молекулярной массы, рассматривая многоцветное совпадение. А как насчет гомовзаимодействий? Решение заключается в анализе яркости. Эти методы используют неоднородность в распределении интенсивности флуоресценции для измерения молекулярной яркости различных видов в образце. Поскольку димеры будут содержать в два раза больше флуоресцентных меток, чем мономеры, их молекулярная яркость будет примерно вдвое больше, чем у мономеров. В результате относительная яркость является чувствительной мерой олигомеризации. Средняя молекулярная яркость ( ) связана с дисперсией ( ) и средней интенсивностью ( ) следующим образом: ^[48] ${\displaystyle \langle \epsilon \rangle }$ ${\displaystyle \sigma ^{2}}$ ${\displaystyle \langle I\rangle }$

${\displaystyle \ \langle \varepsilon \rangle ={\frac {\sigma ^{2}-\langle I\rangle }{\langle I\rangle }}=\sum _{i}f_{i}\varepsilon _{i}}$

Здесь и — относительная интенсивность и молекулярная яркость, соответственно, видов . Метод анализа яркости может быть использован для изучения взаимодействия биомолекул при связывании нефлуоресцентного реагента с флуоресцентным. ^[49] Образование комплекса вызывает изменение интенсивности яркости из-за стерического экранирования, переноса заряда, скорости фотоизомеризации или комбинации этих явлений, что позволяет отличить реагент от продукта. ${\displaystyle f_{i}}$ ${\displaystyle \epsilon _{i}}$ ${\displaystyle i}$

FRET-FCS

Другой подход на основе FCS для изучения молекулярных взаимодействий использует флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) вместо флуоресценции и называется FRET-FCS. ^[50] При FRET есть два типа зондов, как и при FCCS; однако есть только один канал, и свет обнаруживается только тогда, когда два зонда находятся очень близко — достаточно близко, чтобы обеспечить взаимодействие. Сигнал FRET слабее, чем при флуоресценции, но имеет то преимущество, что есть только сигнал во время реакции (кроме автофлуоресценции ).

Сканирование FCS

В сканирующей флуоресцентной корреляционной спектроскопии (sFCS) измерительный объем перемещается по образцу определенным образом. Введение сканирования мотивировано его способностью смягчать или устранять несколько отдельных проблем, часто встречающихся в стандартной FCS, и, таким образом, расширять область применимости методов флуоресцентной корреляции в биологических системах. ^[51]

Некоторые вариации FCS применимы только к серийным сканирующим лазерным микроскопам. Корреляционная спектроскопия изображений и ее вариации были реализованы на сканирующем конфокальном или сканирующем двухфотонном микроскопе, но перенесены на другие микроскопы, такие как конфокальный микроскоп с вращающимся диском. Растровая ICS (RICS), ^[52] и позиционно-чувствительная FCS (PSFCS) ^[53] включают временную задержку между частями сканирования изображения в анализ. Кроме того, низкоразмерные сканирования (например, круглое кольцо) ^[54] —возможные только в сканирующей системе — могут получить доступ к временным шкалам между измерениями одной точки и полного изображения. Путь сканирования также был сделан адаптивно отслеживающим частицы. ^[55]

Вращающийся диск FCS и пространственное картирование

Любой из методов спектроскопии корреляции изображений может также быть выполнен на вращающемся дисковом конфокальном микроскопе, который на практике может получить более высокую скорость получения изображений по сравнению с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. Этот подход недавно был применен к диффузии в пространственно-изменяющейся сложной среде, создавая карту пиксельного разрешения коэффициента диффузии. ^[56] Пространственное картирование диффузии с помощью FCS впоследствии было распространено на систему TIRF. ^[57] Пространственное картирование динамики с использованием методов корреляции применялось и раньше, но только в разреженных точках ^[58] или при грубом разрешении. ^[59]

Корреляционная спектроскопия изображений (ICS)

Когда движение медленное (например, в биологии, диффузия в мембране), получение адекватной статистики из одноточечного эксперимента FCS может занять непозволительно много времени. Больше данных можно получить, проводя эксперимент в нескольких пространственных точках параллельно, используя лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Этот подход был назван спектроскопией корреляции изображений (ICS). ^[60] Затем измерения можно усреднить.

Другая вариация ICS выполняет пространственную автокорреляцию на изображениях, что дает информацию о концентрации частиц. ^[61] Затем корреляция усредняется по времени. В то время как белый шум камеры не автокорреляцируется во времени, он автокорреляцируется в пространстве - это создает амплитуду белого шума в пространственной автокорреляционной функции, которую необходимо учитывать при подгонке амплитуды автокорреляции для того, чтобы найти концентрацию флуоресцентных молекул.

Естественным расширением версий временной и пространственной корреляции является пространственно-временная ICS (STICS). ^[59] В STICS нет явного усреднения в пространстве или времени (только усреднение, присущее корреляции). В системах с неизотропным движением (например, направленный поток, асимметричная диффузия) STICS может извлекать направленную информацию. Разновидностью, которая тесно связана с STICS (преобразованием Фурье), является k -пространственная корреляционная спектроскопия изображений (kICS). ^[62]

Существуют также кросс-корреляционные версии ICS, которые могут дать концентрацию, распределение и динамику колокализованных флуоресцентных молекул. ^[60] Молекулы считаются колокализованными, когда отдельные вклады флуоресценции неразличимы из-за перекрывающихся функций рассеяния точек интенсивностей флуоресценции.

Корреляционная спектроскопия изображений частиц (PICS)

Источник: ^[63]

PICS — это мощный инструмент анализа, который разрешает корреляции на нанометровой длине и миллисекундной шкале времени. Адаптированный из методов спектроскопии пространственно-временной корреляции изображений ^[59] , он использует высокую позиционную точность отслеживания отдельных частиц. В то время как обычные методы отслеживания выходят из строя, если пересекаются траектории нескольких частиц, этот метод в принципе работает для произвольно больших плотностей молекул и динамических параметров (например, коэффициентов диффузии, скоростей), пока можно идентифицировать отдельные молекулы. Он вычислительно дешев и надежен и позволяет идентифицировать и количественно оценивать движения (например, диффузию, активный транспорт, ограниченную диффузию) внутри ансамбля частиц без каких-либо априорных знаний о динамике.

Расширение спектроскопии кросс-корреляции изображений частиц (PICCS) доступно для биологических процессов, в которых задействовано несколько партнеров взаимодействия, что можно наблюдать с помощью двухцветной микроскопии. ^[64]

FCS сверхвысокое разрешение оптической флуктуационной визуализации (fcsSOFI)

Оптическая флуктуационная визуализация сверхвысокого разрешения (SOFI) — это метод сверхвысокого разрешения, который достигает пространственных разрешений ниже дифракционного предела путем анализа постобработки с корреляционными уравнениями, аналогично FCS. В то время как оригинальные отчеты SOFI использовали флуктуации от стационарных, мерцающих флуорофоров, FCS был объединен с SOFI, где флуктуации производятся от диффузных зондов для получения пространственных карт сверхвысокого разрешения коэффициентов диффузии. ^[65] Это было применено для понимания диффузии и пространственных свойств пористых и ограниченных материалов. Это включает агарозу ^[65] и реагирующие на температуру гидрогели PNIPAM, ^[66] жидкие кристаллы ^[65] и разделенные на фазы полимеры и конденсаты РНК/белка. ^[67]

Полное внутреннее отражение FCS

Флуоресценция полного внутреннего отражения (TIRF) — это подход микроскопии, который чувствителен только к тонкому слою вблизи поверхности покровного стекла, что значительно минимизирует фоновую флуоресценцию. FCS был распространен на этот тип микроскопа и называется TIR-FCS. ^[68] Поскольку интенсивность флуоресценции в TIRF падает экспоненциально с расстоянием от покровного стекла (вместо гауссовской функции с конфокальной), функция автокорреляции отличается.

Визуализация FCS с использованием микроскопии флуоресценции светового листа

Флуоресцентная микроскопия светового листа или селективная плоскостная микроскопия изображений (SPIM) использует освещение, которое осуществляется перпендикулярно направлению наблюдения, с помощью тонкого листа (лазерного) света. При определенных условиях этот принцип освещения может быть объединен с флуоресцентной корреляционной спектроскопией, чтобы обеспечить пространственно-разрешенную визуализацию подвижности и взаимодействия флуоресцирующих частиц, таких как белки, меченые GFP, внутри живых биологических образцов. ^[69]

Другие подходы к динамике флуоресценции

Существуют две основные некорреляционные альтернативы FCS, которые широко используются для изучения динамики флуоресцентных видов.

Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)

В FRAP область кратковременно подвергается воздействию интенсивного света, необратимо фотообесцвечивающего флуорофоры, и визуализируется восстановление флуоресценции из-за диффузии близлежащих (необесцвеченных) флуорофоров. Основным преимуществом FRAP перед FCS является простота интерпретации качественных экспериментов, распространенных в клеточной биологии. Различия между клеточными линиями или областями клетки, или до и после применения препарата, часто можно охарактеризовать простым просмотром фильмов. Эксперименты FCS требуют определенного уровня обработки и более чувствительны к потенциально искажающим влияниям, таким как: вращательная диффузия, вибрации, фотообесцвечивание, зависимость от освещения и цвета флуоресценции, неадекватная статистика и т. д. Гораздо проще изменить объем измерения в FRAP, что обеспечивает больший контроль. На практике объемы, как правило, больше, чем в FCS. Хотя эксперименты FRAP, как правило, более качественные, некоторые исследователи изучают FRAP количественно и включают динамику связывания. ^[70] Недостатком FRAP в клеточной биологии является возмущение клетки свободными радикалами, вызванное фотообесцвечиванием. Он также менее универсален, поскольку не может измерять концентрацию или вращательную диффузию, или колокализацию. FRAP требует значительно более высокой концентрации флуорофоров, чем FCS.

Отслеживание частиц

При отслеживании частиц траектории набора частиц измеряются, как правило, путем применения алгоритмов отслеживания частиц к фильмам.[1] Отслеживание частиц имеет то преимущество, что вся динамическая информация сохраняется в измерении, в отличие от FCS, где корреляция усредняет динамику до одной гладкой кривой. Преимущество очевидно в системах, показывающих сложную диффузию, где прямое вычисление среднеквадратичного смещения позволяет проводить прямое сравнение с нормальной или степенной диффузией. Чтобы применить отслеживание частиц, частицы должны быть различимы и, следовательно, иметь более низкую концентрацию, чем требуется для FCS. Кроме того, отслеживание частиц более чувствительно к шуму, который иногда может непредсказуемо влиять на результаты.

Автофлуоресцентная корреляционная спектроскопия

Недавние достижения в области ультрафиолетовой нанофотоники привели к развитию исследований отдельных молекул безметковых белков путем их возбуждения глубоким ультрафиолетовым светом и изучения динамических процессов. ^{[71] [72] [73]}

Двух- и трехфотонное возбуждение FCS

Несколько преимуществ как в пространственном разрешении, так и в минимизации фотоповреждения/фотообесцвечивания в органических и/или биологических образцах достигаются с помощью двухфотонного или трехфотонного возбуждения FCS. ^{[74] [75] [76] [77] [78]}

Смотрите также

• Конфокальная микроскопия
• Коэффициент диффузии
• Динамическое рассеяние света
• Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (ФККС)
• Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)

Ссылки

1. Чен, Х., Фаркас, Э. и Уэбб, В. (2008). Применение флуоресцентной корреляционной спектроскопии in vivo. Биофизические инструменты для биологов, том 2: Методы in vivo, 89, 3-+.
2. Квапишевска, К.; Щепаньский, К.; Кальварчик, Т.; Михальска, Б.; Паталас-Кравчик, П.; Шиманский, Ю.; Андрышевский, Т.; Иван, М.; Душинский, Ю.; Холист, Р. (2020). «Наномасштабная вязкость цитоплазмы сохраняется в клеточных линиях человека». Дж. Физ. хим. Летт . 11 (16): 6914–6920. doi : 10.1021/acs.jpclett.0c01748 . ПМК  7450658 . ПМИД  32787203.
3. Квапишевская, Карина; Кальварчик, Томаш; Михальска, Бернадета; Щепанский, Кшиштоф; Шиманский, Енджей; Паталас-Кравчик, Полина; Андрышевский, Томаш; Иван, Михалина; Душиньский, Ежи; Холист, Роберт (2019). «Определение состояния олигомеризации белка Drp1 в живых клетках при наномолярных концентрациях». Научные отчеты . 9 (1): 5906. Бибкод : 2019НатСР...9.5906К. дои : 10.1038/s41598-019-42418-0 . ПМК 6459820 . ПМИД  30976093. 
4. Квапишевская, Карина; Кальварчик, Томаш; Михальска, Бернадета; Щепанский, Кшиштоф; Шиманский, Енджей; Паталас-Кравчик, Полина; Андрышевский, Томаш; Иван, Михалина; Душиньский, Ежи; Холист, Роберт (2019). «Определение состояния олигомеризации белка Drp1 в живых клетках при наномолярных концентрациях». Научные отчеты . 9 (1): 5906. Бибкод : 2019НатСР...9.5906К. дои : 10.1038/s41598-019-42418-0 . ПМК 6459820 . ПМИД  30976093. 
5. Магде, Д.; Элсон, Э.Л.; Уэбб, В.В. (1972). «Термодинамические флуктуации в реагирующей системе: измерение с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Phys Rev Lett . 29 (11): 705–708. Bibcode : 1972PhRvL..29..705M. doi : 10.1103/physrevlett.29.705.
6. Эренберг, М.; Риглер, Р. (1974). «Вращательное броуновское движение и флуктуации интенсивности флуоресценции». Chem Phys . 4 (3): 390–401. Bibcode : 1974CP......4..390E. doi : 10.1016/0301-0104(74)85005-6.
7. Элсон, Э. Л.; Магде, Д. «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия I. Концептуальная основа и теория, (1974)». Биополимеры . 13 : 1–27. doi :10.1002/bip.1974.360130102. S2CID  97201376.
8. Magde, D.; Elson, EL; Webb, WW (1974). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия II. Экспериментальная реализация». Биополимеры . 13 (1): 29–61. doi :10.1002/bip.1974.360130103. PMID  4818131. S2CID  2832069.
9. Qian, H.; Elson, EL (1991). «Анализ оптики конфокального лазерного микроскопа для 3-D флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Applied Optics . 30 (10): 1185–1195. Bibcode : 1991ApOpt..30.1185Q. doi : 10.1364/AO.30.001185. PMID  20582127.
10. Палмер, АГ; Томпсон, НЛ (1989). «Анализ флуктуаций флуоресценции высокого порядка модельных белковых кластеров». Proc Natl Acad Sci USA . 86 (16): 6148–6152. Bibcode : 1989PNAS...86.6148P. doi : 10.1073/pnas.86.16.6148 . PMC 297794. PMID  2548201 . 
11. Qian, H.; Elson, EL (1990). «Распределение молекулярной агрегации по анализу моментов флуктуации». Proc Natl Acad Sci USA . 87 (14): 5479–5483. Bibcode : 1990PNAS...87.5479Q. doi : 10.1073 /pnas.87.14.5479 . PMC 54348. PMID  2371284. 
12. Томпсон Н.Л. 1991 Темы в области флуоресцентной спектроскопии, том 1, под ред. Дж. Р. Лаковича (Нью-Йорк: Пленум), стр. 337–78
13. Риглер, Р., У. Метс1, Дж. Виденгрен и П. Каск. «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия с высокой скоростью счета и низким фоном: анализ трансляционной диффузии». Европейский биофизический журнал (1993) 22(3), 159.
14. Эйген, М.; Риглер, М. (1994). «Сортировка отдельных молекул: применение в диагностике и эволюционной биотехнологии». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 91 (13): 5740–5747. Bibcode : 1994PNAS...91.5740E. doi : 10.1073 /pnas.91.13.5740 . PMC 44073. PMID  7517036. 
15. Риглер, М. (1995). «Корреляции флуоресценции, обнаружение отдельных молекул и скрининг большого числа. Применение в биотехнологии». J. Biotechnol . 41 (2–3): 177–186. doi :10.1016/0168-1656(95)00054-t. PMID  7544589.
16. Кричевский, О.; Бонне, Г. (2002). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: техника и ее применение». Rep. Prog. Phys . 65 (2): 251–297. Bibcode :2002RPPh...65..251K. doi :10.1088/0034-4885/65/2/203. S2CID  49429529.
17. Медина, MA; Швилле, П. (2002). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия для обнаружения и изучения отдельных молекул в биологии». BioEssays . 24 (8): 758–764. doi :10.1002/bies.10118. PMID  12210537. S2CID  3860264.
18. Mayboroda, OA; van Remoortere, A.; Tanke, HJ; Hokke, CH; Deelder, AM (2003). «Новый подход к иммуноанализам на основе флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS)». J. Biotechnol . 107 (2): 185–192. doi :10.1016/j.jbiotec.2003.10.007. PMID  14711501.
19. Hess, ST; Webb, WW (2002). «Оптика фокусного объема и экспериментальные артефакты в конфокальной флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Biophys. J . 83 (4): 2300–2317. Bibcode :2002BpJ....83.2300H. doi :10.1016/s0006-3495(02)73990-8. PMC 1302318 . PMID  12324447. 
20. Хёфлинг, Ф.; Бамберг, К.-У. и Франош, Т. (2011). «Аномальный транспорт, разрешенный в пространстве и времени с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Soft Matter . 7 (4): 1358–1363. arXiv : 1003.3762 . Bibcode :2011SMat....7.1358H. doi :10.1039/C0SM00718H. S2CID  18905838.
21. Banks, DS; Fradin, C. (2005). «Аномальная диффузия белков из-за молекулярного скопления». Biophys. J . 89 (5): 2960–2971. Bibcode :2005BpJ....89.2960B. doi :10.1529/biophysj.104.051078. PMC 1366794 . PMID  16113107. 
22. Сенгупта, П.; Гарай, К.; Баладжи, Дж.; Периасами, Н.; Маити, С. (2003). «Измерение распределения размеров в высокогетерогенных системах с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Biophys. J . 84 (3): 1977–1984. Bibcode :2003BpJ....84.1977S. doi :10.1016/s0006-3495(03)75006-1. PMC 1302767 . PMID  12609900. 
23. Kohler, RH; Schwille, P.; Webb, WW; Hanson, MR (2000). «Активный транспорт белка через пластидные трубочки: скорость, определенная с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии». J Cell Sci . 113 (22): 3921–3930. doi :10.1242/jcs.113.22.3921. PMID  11058079.
24. Виденгрен, Дж.; Метс; Риглер, Р. (1995). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия триплетных состояний в растворе: теоретическое и экспериментальное исследование». J. Chem. Phys . 99 (36): 13368–13379. doi :10.1021/j100036a009.
25. Берланд, К. М. (2004). «Обнаружение специфических последовательностей ДНК с использованием двухцветной двухфотонной флуоресцентной корреляционной спектроскопии». J. Biotechnol . 108 (2): 127–136. doi :10.1016/j.jbiotec.2003.11.006. PMID  15129721.
26. Мюллер, CB; Ломан, A.; Пачеко, V.; Коберлинг, F.; Виллболд, D.; Рихтеринг, W.; Эндерляйн, J. (2008). "Точное измерение диффузии с помощью многоцветной двухфокусной флуоресцентной корреляционной спектроскопии". EPL . 83 (4): 46001. Bibcode :2008EL.....8346001M. doi :10.1209/0295-5075/83/46001. S2CID  123509143.
27. Ван, Ф.; Ши, И.; Луо, С.; Чэнь, И.; Чжао, Дж. (2012). «Конформационный переход одиночных цепей поли(N-изопропилакриламида) в процессе его конконсолидации: исследование с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии и масштабного анализа. (2012)». Макромолекулы . 45 (22): 9196–9204. Bibcode : 2012MaMol..45.9196W. doi : 10.1021/ma301780f. S2CID  94553710.
28. Пристински, Д.; Козловская, В.; Сухишвили, СА (2005). "Исследования диффузии слабого полиэлектролита в водных растворах методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии". J. Chem. Phys . 122 (1): 014907. Bibcode :2005JChPh.122a4907P. doi :10.1063/1.1829255. PMID  15638700.
29. Виденгрен, Дж.; Швилле, П. (2000). «Характеристика фотоиндуцированной изомеризации и обратной изомеризации цианинового красителя Cy5 с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии. (2000)». J. Phys. Chem. A. 104 ( 27): 6416–6428. Bibcode : 2000JPCA..104.6416W. doi : 10.1021/jp000059s.
30. Ломан, А.; Дертингер, Т.; Коберлинг, Ф.; Эндерляйн, Дж. (2008). «Сравнение эффектов оптического насыщения в обычной и двухфокусной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (2008)». Chem. Phys. Lett . 459 (1): 18–21. Bibcode :2008CPL...459...18L. doi :10.1016/j.cplett.2008.05.018.
31. Petraaek; Schwille, P. (2008). «Точное измерение коэффициентов диффузии с использованием сканирующей флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Biophys. J . 94 (4): 1437–1448. Bibcode :2008BpJ....94.1437P. doi :10.1529/biophysj.107.108811. PMC 2212689 . PMID  17933881. 
32. Ваврезиник и др. (2005) Biophys J.
33. Ленн и др. (2006) EMBO J.
34. Гия и др. (2011) Научный сигнал.
35. Рупрехт и др. (2011) Биофиз Дж.
36. Бийодо и др. (2013) Методы энзимологии
37. Масуда и др. (2005) Биофиз Дж.
38. Гумполикова и др. (2006) Биофиз Дж.
39. Венгер и др. (2007) Biophys J.
40. Эггелинг и др. (2009) Природа
41. Месет, У.; Воланд, Т.; Риглер, Р.; Фогель, Х. (1999). «Разрешение измерений корреляции флуоресценции. (1999)». Biophys. J . 76 (3): 1619–1631. Bibcode :1999BpJ....76.1619M. doi :10.1016/s0006-3495(99)77321-2. PMC 1300138 . PMID  10049342. 
42. Дигман, МА; Далал, Р.; Хорвиц, АФ; Граттон, Э. (2008). «Картирование числа молекул и яркости в лазерном сканирующем микроскопе». Biophys. J . 94 (6): 2320–2332. Bibcode :2008BpJ....94.2320D. doi :10.1529/biophysj.107.114645. PMC 2257897 . PMID  18096627. 
43. Чен, Y.; Мюллер, JD; Со, PTC; Граттон, E. (1999). «Гистограмма подсчета фотонов в спектроскопии флуоресцентных флуктуаций». Biophys. J . 77 (1): 553–567. Bibcode :1999BpJ....77..553C. doi :10.1016/s0006-3495(99)76912-2. PMC 1300352 . PMID  10388780. 
44. Kask, P.; Palo, K.; Ullmann, D.; Gall, K. (1999). «Анализ распределения интенсивности флуоресценции и его применение в технологии обнаружения биомолекул». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 96 (24): 13756–13761. Bibcode : 1999PNAS...9613756K. doi : 10.1073 /pnas.96.24.13756 . PMC 24137. PMID  10570145. 
45. Мюллер, Дж. Д. (2004). «Анализ кумулянтов в спектроскопии флуоресцентных флуктуаций». Biophys. J . 86 (6): 3981–3992. Bibcode :2004BpJ....86.3981M. doi :10.1529/biophysj.103.037887. PMC 1304299 . PMID  15189894. 
46. Годен, Антуан (26 апреля 2011 г.). «Выявление олигомеризации и плотности белков in situ с использованием анализа распределения пространственной интенсивности». PNAS . 108 (17): 7010–7015. Bibcode :2011PNAS..108.7010G. doi : 10.1073/pnas.1018658108 . PMC 3084122 . PMID  21482753. 
47. Ичбилир, Али (2021). «Определение олигомеризации рецепторов, связанных с G-белком, с помощью анализа молекулярной яркости в отдельных клетках» (PDF) . Nature Protocols . 16 (3): 1419–1451. doi :10.1038/s41596-020-00458-1. PMID  33514946. S2CID  231768809.
48. Qian, H.; Elson, EL (1990). «Об анализе моментов высокого порядка флуктуаций флуоресценции». Biophys. J . 57 (2): 375–380. Bibcode :1990BpJ....57..375Q. doi :10.1016/s0006-3495(90)82539-x. PMC 1280678 . PMID  2317556. 
49. Белец, Кшиштоф; Ковальски, Адам. «Ионное комплексообразование объясняет порядки изменений величины константы равновесия биохимических реакций в буферах, переполненных неионными соединениями». Журнал писем по физической химии .
50. Remaut, K.; Lucas, B.; Braeckmans, K.; Sanders, NN; Smedt, SC De; Demeester, J. (2005). «FRET-FCS как инструмент для оценки стабильности олигонуклеотидных препаратов после внутриклеточной доставки». J Control Rel . 103 (1): 259–271. doi :10.1016/j.jconrel.2004.11.019. PMID  15710516.
51. Mashaghi, A.; et al. (2008). «Характеристика динамики белков при асимметричном делении клеток с помощью сканирующей флуоресцентной корреляционной спектроскопии». Biophysical Journal . 95 (11): 5476–5486. Bibcode :2008BpJ....95.5476P. doi :10.1529/biophysj.108.135152. PMC 2586573 . PMID  18805921. 
52. Digman, MA; Sengupta, P.; Wiseman, PW; Brown, CM; Horwitz, AR; Gratton, E. (2005). «Флуктуационная корреляционная спектроскопия с лазерным сканирующим микроскопом: использование скрытой временной структуры». Biophys. J . 88 (5): L33–36. Bibcode :2005BpJ....88L..33D. doi :10.1529/biophysj.105.061788. PMC 1305524 . PMID  15792971. 
53. Скиннер, Дж. П.; Чен, И.; Мюллер, Дж. Д. (2005). «Позиционно-чувствительная сканирующая флуоресцентная корреляционная спектроскопия». Biophys. J . 89 (2): 1288–1301. Bibcode :2005BpJ....89.1288S. doi :10.1529/biophysj.105.060749. PMC 1366613 . PMID  15894645. 
54. Ruan, Q.; Cheng, MA; Levi, M.; Gratton, E.; Mantulin, WW (2004). «Пространственно-временные исследования динамики мембран: сканирующая флуоресцентная корреляционная спектроскопия (SFCS)». Biophys. J . 87 (2): 1260–1267. Bibcode :2004BpJ....87.1260R. doi :10.1529/biophysj.103.036483. PMC 1304464 . PMID  15298928. 
55. Берглунд, А.; Мабучи, Х. (2005). «Отслеживание-FCS: флуоресцентная корреляционная спектроскопия отдельных частиц» (PDF) . Opt. Express . 13 (20): 8069–8082. Bibcode :2005OExpr..13.8069B. doi : 10.1364/opex.13.008069 . PMID  19498837.
56. Sisan, DR; Arevalo, R.; Graves, C.; McAllister, R.; Urbach, JS (2006). «Пространственно разрешенная флуоресцентная корреляционная спектроскопия с использованием конфокального микроскопа с вращающимся диском». Biophysical Journal . 91 (11): 4241–4252. Bibcode :2006BpJ....91.4241S. doi :10.1529/biophysj.106.084251. PMC 1635679 . PMID  16950838. 
57. Каннан, Б.; Го, Л.; Судхахаран, Т.; Ахмед, С.; Маруяма, И.; Воланд, Т. (2007). «Пространственно разрешенная флуоресцентная корреляционная микроскопия полного внутреннего отражения с использованием камеры с электронным умножением и зарядовой связью». Аналитическая химия . 79 (12): 4463–4470. doi :10.1021/ac0624546. PMID  17489557.
58. Ваксмут, М.; Вальдек, В.; Ланговски, Дж. (2000). «Аномальная диффузия флуоресцентных зондов внутри ядер живых клеток, исследованная с помощью пространственно-разрешенной флуоресцентной корреляционной спектроскопии». J. Mol. Biol . 298 (4): 677–689. doi :10.1006/jmbi.2000.3692. PMID  10788329. S2CID  21791229.
59. Hebert, B.; Constantino, S.; Wiseman, PW (2005). «Пространственно-временная спектроскопия корреляции изображений (STICS): теория, проверка и применение для картирования скорости белка в живых клетках CHO». Biophys. J . 88 (5): 3601–3614. Bibcode :2005BpJ....88.3601H. doi :10.1529/biophysj.104.054874. PMC 1305507 . PMID  15722439. 
60. Wiseman, PW; Squier, JA; Ellisman, MH; Wilson, KR (2000). "Двухфотонная видеоскоростная спектроскопия корреляции изображений (ICS) и спектроскопия кросс-корреляции изображений (ICCS)". J. Microsc . 200 (Pt 1): 14–25. doi :10.1046/j.1365-2818.2000.00736.x. PMID  11012824. S2CID  6554931.
61. Петерсен, НО; Вайсман, П. В.; Сегер, О.; Магнуссон, К. Э. (1993). «Количественная оценка распределений мембранных рецепторов с помощью спектроскопии корреляции изображений: концепция и применение». Biophys. J . 65 (3): 1135–1146. Bibcode :1993BpJ....65.1135P. doi :10.1016/S0006-3495(93)81173-1. PMC 1225831 . PMID  8241393. 
62. Колин, DL; Ронис, D.; Вайсман, PW (2006). «Спектроскопия корреляции изображений в k-пространстве: метод точных измерений переноса, независимый от фотофизики флуорофоров». Biophys. J . 91 (8): 3061–3075. Bibcode :2006BpJ....91.3061K. doi :10.1529/biophysj.106.082768. PMC 1578478 . PMID  16861272. 
63. Semrau, S.; Schmidt, T. (2007). «Корреляционная спектроскопия изображений частиц (PICS): извлечение корреляций в нанометровом масштабе из данных о положении одиночных молекул высокой плотности». Biophys. J . 92 (2): 613–621. Bibcode :2007BpJ....92..613S. doi :10.1529/biophysj.106.092577. PMC 1751376 . PMID  17085496. 
64. Semrau, S.; Holtzer, L.; Gonzalez-Gaitan, M.; Schmidt, T. (2011). «Количественная оценка биологических взаимодействий с помощью кросс-корреляционной спектроскопии изображений частиц (PICCS)». Biophys. J . 100 (7): 1810–1818. Bibcode :2011BpJ...100.1810S. doi :10.1016/j.bpj.2010.12.3746. PMC 3072609 . PMID  21463595. 
65. Kisley, L.; Higgins, D.; Weiss, S.; Landes, CF (2015). «Характеристика пористых материалов с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Оптическая флуктуационная визуализация сверхвысокого разрешения». ACS Nano . 9 (9): 9158–9166. doi :10.1021/acsnano.5b03430. PMC 10706734. PMID  26235127 . 
66. Дутта, К.; Бишоп, Л.Д.К.; Ландес, К.Ф. (2020). «Визуализация переключаемых взаимодействий белков с активной пористой полимерной подложкой». J. Phys. Chem. B. 124 ( 22): 4412–4420. doi :10.1021/acs.jpcb.0c01807. PMID  32441098. S2CID  218836568.
67. Шаеган, М.; Михник, SW; Лесли, SL (2019). «Исследование неоднородной диффузии в микросредах полимеров с разделенными фазами в условиях ограничения». J. Am. Chem. Soc . 141 (19): 7751–7757. doi :10.1021/jacs.8b13349. PMID  31017394. S2CID  129941554.
68. Lieto, AM; Thompson, NL (2004). «Полное внутреннее отражение с флуоресцентной корреляционной спектроскопией: нефлуоресцентные конкуренты». Biophys. J . 87 (2): 1268–1278. Bibcode :2004BpJ....87.1268L. doi :10.1529/biophysj.103.035030. PMC 1304465 . PMID  15298929. 
69. Capoulade, J.; Wachsmuth, M.; Hufnagel, L.; Knop, M. (сентябрь 2011 г.). «Количественная флуоресцентная визуализация диффузии и взаимодействия белков в живых клетках». Nature Biotechnology . 29 (9): 835–839. doi :10.1038/nbt.1928. PMID  21822256. S2CID  10493584.
70. Sprague, BL; McNally, JG (2005). «Анализ связывания FRAP: правильный и подходящий». Trends in Cell Biology . 15 (2): 84–91. doi :10.1016/j.tcb.2004.12.001. PMID  15695095.
71. Барулин, Александр; Клод, Жан-Бенуа; Патра, Сатьяджит; Бонод, Николя; Венгер, Жером (9 октября 2019 г.). «Глубокое ультрафиолетовое плазмонное усиление автофлуоресценции одиночных белков в волноводах с нулевым режимом». Nano Letters . 19 (10): 7434–7442. arXiv : 1909.08227 . Bibcode : 2019NanoL..19.7434B. doi : 10.1021/acs.nanolett.9b03137. PMID  31526002. S2CID  202660648.
72. Барулин, Александр; Рой, Притху; Клод, Жан-Бенуа; Венгер, Жером (5 апреля 2022 г.). «Ультрафиолетовые оптические рупорные антенны для обнаружения отдельных белков без меток». Nature Communications . 13 (1): 1842. arXiv : 2204.02807 . Bibcode :2022NatCo..13.1842B. doi :10.1038/s41467-022-29546-4. PMC 8983662 . PMID  35383189. 
73. Рой, Притху; Клод, Жан-Бенуа; Тивари, Санни; Барулин, Александр; Венгер, Жером (5 января 2023 г.). «Ультрафиолетовая нанофотоника позволяет проводить автофлуоресцентную корреляционную спектроскопию на белках без меток с одним триптофаном». Nano Letters . 23 (2): 497–504. arXiv : 2301.01516 . Bibcode : 2023NanoL..23..497R. doi : 10.1021/acs.nanolett.2c03797. PMID  36603115. S2CID  255416119.
74. Диаспро, А.; Робелло, М. (1999). «Микроскопия с многофотонным возбуждением для изучения биосистем». Европейская микроскопия и анализ . 5 : 5–7.
75. Багатолли, LA; Граттон, E. (2000). «Двухфотонная флуоресцентная микроскопия сосуществующих липидных доменов в гигантских однослойных везикулах бинарных смесей фосфолипидов». Biophys J . 78 (1): 290–305. Bibcode :2000BpJ....78..290B. doi :10.1016/s0006-3495(00)76592-1. PMC 1300637 . PMID  10620293. 
76. Schwille, P.; Haupts, U.; Maiti, S.; Webb, W. (1999). «Молекулярная динамика в живых клетках, наблюдаемая с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии с одно- и двухфотонным возбуждением». Biophysical Journal . 77 (10): 2251–2265. Bibcode :1999BpJ....77.2251S. doi :10.1016/S0006-3495(99)77065-7. PMC 1300505 . PMID  10512844. 
77. Микроспектроскопия в ближнем инфракрасном диапазоне, флуоресцентная микроспектроскопия, инфракрасная химическая визуализация и ядерно-магнитный резонансный анализ высокого разрешения семян сои, соматических зародышей и отдельных клеток., Baianu, IC et al. 2004., In Oil Extraction and Analysis. , D. Luthria, Editor pp.241–273, AOCS Press., Champaign, IL.
78. Обнаружение отдельных раковых клеток с помощью ближней инфракрасной микроспектроскопии, инфракрасной химической визуализации и флуоресцентной микроспектроскопии. 2004. IC Baianu, D. Costescu, NE Hofmann и SS Korban, q-bio/0407006 (июль 2004 г.)

Дальнейшее чтение

• Риглер Р. и Виденгрен Дж. (1990). Сверхчувствительное обнаружение отдельных молекул с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, BioScience (ред. Клинге и Оуман) стр. 180
• Oehlenschläger, F.; Schwille, P.; Eigen, M. (1996). «Обнаружение РНК ВИЧ-1 с помощью амплификации на основе последовательности нуклеиновой кислоты в сочетании с флуоресцентной корреляционной спектроскопией». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 93 (23): 12811–12816. Bibcode : 1996PNAS...9312811O. doi : 10.1073 /pnas.93.23.12811 . PMC  24002. PMID  8917501.

Внешние ссылки

• Хаустейн, Эльке; Швилле, Петра (2004). «Спектроскопические методы одиночных молекул». Current Opinion in Structural Biology . 14 (5): 531–540. doi : 10.1016/j.sbi.2004.09.004. hdl : 11858/00-001M-0000-0029-D76C-C . PMID  15465312.
• Класс FCS
• Учебное пособие по FCS Института Стоуэрса
• Учебное пособие по миграции клеток FCS Консорциума Архивировано 24.09.2010 на Wayback Machine
• Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) (Becker & Hickl GmbH, веб-страница)