Флуоресцентная спектроскопия (также известная как флуориметрия или спектрофлуорометрия ) — это тип электромагнитной спектроскопии , которая анализирует флуоресценцию образца. Она включает в себя использование луча света, обычно ультрафиолетового света , который возбуждает электроны в молекулах определенных соединений и заставляет их излучать свет; как правило, но не обязательно, видимый свет . Дополнительным методом является абсорбционная спектроскопия . В особом случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул флуктуации интенсивности излучаемого света измеряются либо от отдельных флуорофоров, либо от пар флуорофоров.
Приборы, измеряющие флуоресценцию, называются флуорометрами .
Молекулы имеют различные состояния, называемые уровнями энергии . Флуоресцентная спектроскопия в первую очередь занимается электронными и колебательными состояниями. Как правило, исследуемый вид имеет основное электронное состояние (состояние с низкой энергией), представляющее интерес, и возбужденное электронное состояние с более высокой энергией. В каждом из этих электронных состояний существуют различные колебательные состояния. [1]
При флуоресценции вид сначала возбуждается, поглощая фотон , из своего основного электронного состояния в одно из различных колебательных состояний в возбужденном электронном состоянии. Столкновения с другими молекулами заставляют возбужденную молекулу терять колебательную энергию, пока она не достигнет самого низкого колебательного состояния из возбужденного электронного состояния. Этот процесс часто визуализируют с помощью диаграммы Яблонского . [1]
Затем молекула снова опускается на один из различных колебательных уровней основного электронного состояния, испуская в этом процессе фотон. [1] Поскольку молекулы могут опускаться на любой из нескольких колебательных уровней в основном состоянии, испускаемые фотоны будут иметь разные энергии и, следовательно, частоты. Поэтому, анализируя разные частоты света, испускаемого во флуоресцентной спектроскопии, вместе с их относительной интенсивностью, можно определить структуру разных колебательных уровней.
Для атомных видов процесс похож; однако, поскольку атомные виды не имеют уровней колебательной энергии, испускаемые фотоны часто имеют ту же длину волны, что и падающее излучение. Этот процесс повторного испускания поглощенного фотона называется «резонансной флуоресценцией», и хотя он характерен для атомной флуоресценции, он также наблюдается и в молекулярной флуоресценции. [2]
При типичном измерении флуоресценции (эмиссии) длина волны возбуждения фиксирована, а длина волны обнаружения варьируется, в то время как при измерении возбуждения флуоресценции длина волны обнаружения фиксирована, а длина волны возбуждения варьируется в пределах интересующей области. Карта эмиссии измеряется путем регистрации спектров эмиссии, полученных из диапазона длин волн возбуждения, и объединения их всех вместе. Это трехмерный набор данных поверхности: интенсивность эмиссии как функция длин волн возбуждения и эмиссии, и обычно изображается в виде контурной карты.
Существуют два основных типа приборов: фильтровые флуориметры , которые используют фильтры для разделения падающего света и флуоресцентного света, и спектрофлуориметры , которые используют монохроматоры с дифракционной решеткой для разделения падающего света и флуоресцентного света.
Оба типа используют следующую схему: свет от источника возбуждения проходит через фильтр или монохроматор и падает на образец. Часть падающего света поглощается образцом, а некоторые молекулы в образце флуоресцируют. Флуоресцентный свет излучается во всех направлениях. Часть этого флуоресцентного света проходит через второй фильтр или монохроматор и достигает детектора, который обычно размещается под углом 90° к падающему световому лучу, чтобы минимизировать риск попадания прошедшего или отраженного падающего света на детектор.
В качестве источников возбуждения могут использоваться различные источники света, включая лазеры, светодиоды и лампы; в частности, ксеноновые дуговые и ртутные лампы . Лазер излучает свет только с высокой интенсивностью излучения в очень узком интервале длин волн, обычно менее 0,01 нм, что делает возбуждающий монохроматор или фильтр ненужным. Недостатком этого метода является то, что длина волны лазера не может быть сильно изменена. Ртутная лампа является линейной лампой, то есть она излучает свет вблизи пиковых длин волн. Напротив, ксеноновая дуговая лампа имеет непрерывный спектр излучения с почти постоянной интенсивностью в диапазоне от 300 до 800 нм и достаточную интенсивность излучения для измерений вплоть до чуть выше 200 нм.
Фильтры и/или монохроматоры могут использоваться во флуориметрах. Монохроматор пропускает свет регулируемой длины волны с регулируемым допуском. Наиболее распространенный тип монохроматора использует дифракционную решетку, то есть коллимированный свет освещает решетку и выходит под разным углом в зависимости от длины волны. Затем монохроматор можно настроить для выбора длины волны для передачи. Для проведения измерений анизотропии необходимо добавить два поляризационных фильтра: один после монохроматора или фильтра возбуждения и один перед монохроматором или фильтром испускания.
Как упоминалось ранее, флуоресценция чаще всего измеряется под углом 90° относительно возбуждающего света. Эта геометрия используется вместо размещения датчика на линии возбуждающего света под углом 180°, чтобы избежать помех проходящего возбуждающего света. Ни один монохроматор не идеален, и он будет пропускать некоторое количество рассеянного света , то есть света с длинами волн, отличными от целевой. Идеальный монохроматор будет пропускать свет только в указанном диапазоне и иметь высокую независимую от длины волны передачу. При измерении под углом 90° только свет, рассеянный образцом, вызывает рассеянный свет. Это приводит к лучшему отношению сигнал/шум и снижает предел обнаружения примерно в 10000 раз [3] по сравнению с геометрией 180°. Кроме того, флуоресценцию также можно измерять спереди, что часто делается для мутных или непрозрачных образцов. [4]
Детектор может быть одноканальным или многоканальным. Одноканальный детектор может определять интенсивность только одной длины волны за раз, тогда как многоканальный детектор определяет интенсивность всех длин волн одновременно, что делает монохроматор или фильтр эмиссии ненужным.
Наиболее универсальные флуориметры с двойными монохроматорами и непрерывным источником возбуждающего света могут регистрировать как спектр возбуждения, так и спектр флуоресценции. При измерении спектров флуоресценции длина волны возбуждающего света поддерживается постоянной, предпочтительно на длине волны высокого поглощения, а монохроматор испускания сканирует спектр. Для измерения спектров возбуждения длина волны, проходящая через фильтр испускания или монохроматор, поддерживается постоянной, а монохроматор возбуждения сканирует. Спектр возбуждения, как правило, идентичен спектру поглощения, поскольку интенсивность флуоресценции пропорциональна поглощению. [5]
При низких концентрациях интенсивность флуоресценции обычно пропорциональна концентрации флуорофора .
В отличие от УФ/видимой спектроскопии, «стандартные», независимые от прибора спектры нелегко получить. Несколько факторов влияют на спектры и искажают их, и для получения «истинных», т. е. машинно-независимых, спектров необходимы поправки. Различные типы искажений здесь будут классифицироваться как связанные с прибором или образцом. Во-первых, обсуждается искажение, возникающее из-за прибора. Для начала, интенсивность источника света и характеристики длины волны изменяются со временем в течение каждого эксперимента и между каждым экспериментом. Кроме того, ни одна лампа не имеет постоянной интенсивности на всех длинах волн. Чтобы исправить это, можно применить расщепитель луча после монохроматора возбуждения или фильтра, чтобы направить часть света на опорный детектор.
Кроме того, необходимо учитывать эффективность пропускания монохроматоров и фильтров. Они также могут меняться со временем. Эффективность пропускания монохроматора также меняется в зависимости от длины волны. Вот почему после монохроматора возбуждения или фильтра следует разместить дополнительный опорный детектор. Процент флуоресценции, улавливаемый детектором, также зависит от системы. Кроме того, квантовая эффективность детектора, то есть процент обнаруженных фотонов, меняется между различными детекторами в зависимости от длины волны и времени, поскольку детектор неизбежно изнашивается.
Две другие темы, которые необходимо рассмотреть, включают оптику, используемую для направления излучения, и средства удержания или содержания материала образца (называемые кюветой или ячейкой). Для большинства измерений в УФ, видимом и ближнем ИК диапазонах необходимо использование прецизионных кварцевых кювет. В обоих случаях важно выбирать материалы, которые имеют относительно небольшое поглощение в интересующем диапазоне длин волн. Кварц идеален, поскольку он пропускает от 200 нм до 2500 нм; кварц более высокого качества может пропускать даже до 3500 нм, тогда как поглощающие свойства других материалов могут маскировать флуоресценцию образца.
Коррекция всех этих инструментальных факторов для получения «стандартного» спектра — утомительный процесс, который применяется на практике только в случае крайней необходимости. Например, при измерении квантового выхода или при нахождении длины волны с наибольшей интенсивностью излучения.
Как упоминалось ранее, искажения возникают также из-за образца. Поэтому необходимо также учитывать некоторые аспекты образца. Во-первых, фоторазложение может уменьшить интенсивность флуоресценции с течением времени. Также необходимо учитывать рассеяние света. Наиболее значимыми типами рассеяния в этом контексте являются рэлеевское и рамановское рассеяние. Свет, рассеянный при рэлеевском рассеянии, имеет ту же длину волны, что и падающий свет, тогда как при рамановском рассеянии рассеянный свет обычно меняет длину волны на более длинные. Рамановское рассеяние является результатом виртуального электронного состояния, вызванного возбуждающим светом. Из этого виртуального состояния молекулы могут вернуться на колебательный уровень, отличный от основного колебательного состояния. [7] В спектрах флуоресценции это всегда видно при постоянной разнице волновых чисел относительно волнового числа возбуждения, например, пик появляется при волновом числе на 3600 см −1 ниже, чем возбуждающий свет в воде.
Другие аспекты, которые следует учитывать, — это эффекты внутреннего фильтра. [8] [9] К ним относится реабсорбция. Реабсорбция происходит, потому что другая молекула или часть макромолекулы поглощает на длинах волн, на которых флуорофор испускает излучение. Если это так, некоторые или все фотоны, испускаемые флуорофором, могут быть снова поглощены. Другой эффект внутреннего фильтра возникает из-за высоких концентраций поглощающих молекул, включая флуорофор. Результатом является то, что интенсивность возбуждающего света не является постоянной во всем растворе. В результате только небольшой процент возбуждающего света достигает флуорофоров, которые видны для системы обнаружения. Эффекты внутреннего фильтра изменяют спектр и интенсивность испускаемого света, и поэтому их необходимо учитывать при анализе спектра излучения флуоресцентного света. [5] [10]
Флуоресценция свернутого белка представляет собой смесь флуоресценции от отдельных ароматических остатков. Большая часть собственной флуоресцентной эмиссии свернутого белка обусловлена возбуждением остатков триптофана , с некоторыми эмиссиями из-за тирозина и фенилаланина; но дисульфидные связи также имеют заметное поглощение в этом диапазоне длин волн. Обычно триптофан имеет длину волны максимального поглощения 280 нм и пик эмиссии, который является сольватохромным , в диапазоне от приблизительно 300 до 350 нм в зависимости от полярности локальной среды [11] Следовательно, флуоресценция белка может использоваться в качестве диагностики конформационного состояния белка. [12] Кроме того, флуоресценция триптофана сильно зависит от близости других остатков ( т. е . близлежащие протонированные группы, такие как Asp или Glu, могут вызывать гашение флуоресценции Trp). Также возможен перенос энергии между триптофаном и другими флуоресцентными аминокислотами, что может повлиять на анализ, особенно в случаях, когда используется кислотный подход Фёрстера. Кроме того, триптофан является относительно редкой аминокислотой; многие белки содержат только один или несколько остатков триптофана. Поэтому флуоресценция триптофана может быть очень чувствительным измерением конформационного состояния отдельных остатков триптофана. Преимущество по сравнению с внешними зондами заключается в том, что сам белок не изменяется. Использование внутренней флуоресценции для изучения конформации белка на практике ограничено случаями с несколькими (или, возможно, только одним) остатками триптофана, поскольку каждый из них испытывает различную локальную среду, что приводит к различным спектрам испускания.
Триптофан является важным собственным флуоресцентным веществом (аминокислотой), которое можно использовать для оценки природы микроокружения триптофана. При проведении экспериментов с денатурантами, поверхностно-активными веществами или другими амфифильными молекулами микроокружение триптофана может измениться. Например, если белок, содержащий один триптофан в своем «гидрофобном» ядре, денатурируется при повышении температуры, появится смещенный в красную сторону спектр испускания. Это происходит из-за воздействия на триптофан водной среды, а не гидрофобной внутренней части белка. Напротив, добавление поверхностно-активного вещества к белку, содержащему триптофан, который подвергается воздействию водного растворителя, вызовет смещенный в синюю сторону спектр испускания, если триптофан встроен в везикулу или мицеллу поверхностно -активного вещества . [13] Белки, в которых отсутствует триптофан, могут быть связаны с флуорофором .
При возбуждении флуоресценции на длине волны 295 нм спектр испускания триптофана доминирует над более слабой флуоресценцией тирозина и фенилаланина .
Флуоресцентная спектроскопия используется, среди прочего, в биохимических, медицинских и химических исследованиях для анализа органических соединений . Также сообщалось о ее использовании для дифференциации злокачественных опухолей кожи от доброкачественных.
Методы атомно-флуоресцентной спектроскопии (AFS) полезны и в других видах анализа/измерения соединений, присутствующих в воздухе, воде или других средах, например, CVAFS , которая используется для обнаружения тяжелых металлов, таких как ртуть.
Флуоресценцию также можно использовать для перенаправления фотонов, см. флуоресцентный солнечный коллектор.
Кроме того, флуоресцентную спектроскопию можно адаптировать к микроскопическому уровню с помощью микрофлуориметрии.
В аналитической химии флуоресцентные детекторы используются совместно с ВЭЖХ .
В области исследования воды флуоресцентная спектроскопия может использоваться для контроля качества воды путем обнаружения органических загрязнителей. [14] Последние достижения в области компьютерной науки и машинного обучения даже позволили обнаружить бактериальное загрязнение воды. [15]
В биомедицинских исследованиях флуоресцентная спектроскопия используется для оценки эффективности распределения лекарственных средств посредством перекрестного связывания флуоресцентных агентов с различными лекарственными средствами. [16]
Флуоресцентная спектроскопия в биофизических исследованиях позволяет визуализировать и характеризовать липидные домены внутри клеточных мембран. [17]