В оптике фотообесцвечивание (иногда называемое выцветанием) представляет собой фотохимическое изменение молекулы красителя или флуорофора, в результате которого она навсегда теряет способность флуоресцировать. Это вызвано разрывом ковалентных связей или неспецифическими реакциями между флуорофором и окружающими молекулами. [1] [2] Такие необратимые изменения в ковалентных связях вызваны переходом из синглетного в триплетное состояние флуорофоров. Количество циклов возбуждения для достижения полного обесцвечивания варьируется. В микроскопии фотообесцвечивание может усложнить наблюдение за флуоресцентными молекулами, поскольку они в конечном итоге будут разрушены световым воздействием, необходимым для стимуляции их флуоресцирования. Это особенно проблематично в покадровой микроскопии .
Однако фотообесцвечивание может также использоваться перед нанесением (в первую очередь антитело -связанных) флуоресцентных молекул, в попытке погасить автофлуоресценцию . Это может помочь улучшить соотношение сигнал/шум .
Фотообесцвечивание также может быть использовано для изучения движения и/или диффузии молекул, например, с помощью метода FRAP , при котором движение клеточных компонентов может быть подтверждено путем наблюдения за восстановлением флуоресценции в месте фотообесцвечивания, или методов FLIP , при которых выполняется несколько раундов фотообесцвечивания, так что можно наблюдать распространение потери флуоресценции в клетке.
Потеря активности, вызванная фотообесцвечиванием, может контролироваться путем уменьшения интенсивности или продолжительности светового воздействия, путем увеличения концентрации флуорофоров, путем уменьшения частоты и, следовательно, энергии фотонов входного света или путем использования более надежных флуорофоров, которые менее склонны к обесцвечиванию (например, цианиновые красители, флуорофоры Alexa или флуорофоры DyLight , красители AttoDyes, красители Janelia и другие). В разумном приближении данная молекула будет разрушена после постоянного воздействия (интенсивность испускания X время испускания X количество циклов), поскольку в постоянной среде каждый цикл поглощения-испускания имеет равную вероятность вызвать фотообесцвечивание.
Фотообесцвечивание является важным параметром для учета в режиме реального времени флуоресцентной визуализации отдельных молекул в биофизике . При интенсивности света, используемой в флуоресцентной визуализации отдельных молекул (0,1-1 кВт/см 2 в типичных экспериментальных установках), даже самые надежные флуорофоры продолжают излучать до 10 секунд перед фотообесцвечиванием за один шаг. Для некоторых красителей время жизни может быть увеличено в 10-100 раз с помощью систем поглощения кислорода (до 1000 секунд с оптимизацией параметров визуализации и отношения сигнал-шум). Например, сочетание протокатеховой кислоты (PCA) и протокатехоат 3,4-диоксигеназы (PCD) часто используется в качестве системы поглощения кислорода, и это увеличивает время жизни флуоресценции более чем на минуту.
В зависимости от своей химической природы молекулы могут фотообесцвечиваться после поглощения всего нескольких фотонов, в то время как более прочные молекулы могут подвергаться многочисленным циклам поглощения/испускания перед разрушением:
Термин «время жизни» не следует путать со «временем жизни», измеренным с помощью флуоресцентной визуализации времени жизни .