l -Фотолейцин - это синтетическое производное аминокислоты l -лейцина , которое используется в качестве его природного аналога и характеризуется фотореактивностью, что делает его пригодным для наблюдения и характеристики белок-белковых взаимодействий (PPI). Когда белок, содержащий эту аминокислоту (A), подвергается воздействию ультрафиолетового света во время взаимодействия с другим белком (B), комплекс, образованный из этих двух белков (AB), остается прикрепленным и может быть выделен для изучения.
Фотолейцин, а также другая фотореактивная аминокислота, полученная из метионина , фотометионин, были впервые синтезированы в 2005 году Моникой Суханек, Анной Радзиковской и Кристофом Тиле [2] из Института молекулярной клеточной биологии и генетики Общества Макса Планка с целью идентификации взаимодействия белков с помощью простого вестерн-блоттинга , который обеспечивал бы высокую специфичность.
Сходство фотореактивных аминокислот с природными позволяет первым избегать обширных механизмов контроля, которые имеют место при синтезе белка в клетке.
Как упоминалось во введении, l -фотолейцин является синтетическим производным аминокислоты l-лейцина. l - фотолейцин характеризуется наличием диазиринового кольца, связанного с радикалом R исходной аминокислоты. Эта циклопропеновая кольцевая молекула состоит из атома углерода, связанного с двумя атомами азота через ковалентную одинарную связь. Эти два атома азота одновременно связаны друг с другом двойной ковалентной связью. Углерод диазирина расположен в положении, где теоретически должен был бы находиться 2-й атом углерода радикала R l -лейцина, связанный с 1-м и 3-м углеродом этого теоретического радикала R. Диазириновое кольцо придает фотолейцину его фотореактивное свойство. При облучении УФ-светом он расщепляется, высвобождая азот в газообразной форме и оставляя несвязанный атом углерода (см. Диазирин ). Во взаимодействиях белок-белок (PPI) этот атом присоединяется к комплексу, образованному двумя белками, которые могут быть изучены.
Остальная часть аминокислоты действительно имеет ту же структуру, что и исходная молекула l -лейцина, которая включает, как и каждая аминокислота, аминогруппу и карбоксильную группу, связанную с α-углеродом, и радикал, который присоединен к этому атому углерода. Цепь R содержит, в этом случае, диазириново кольцо и два дополнительных атома углерода, каждый из которых связан с диазириново углеродом, как это было упомянуто ранее. [3]
Для использования в биологических экспериментах синтезируется только l - энантиомер аминокислоты фотолейцина, чтобы он мог заменить природный l -лейцин. (Природные белки состоят только из l -аминокислот; см. гомохиральность .)
l -Фотолейцин по своей структуре напоминает l -лейцин . Однако последний содержит фотоактивируемое диазириновое кольцо, которого нет в первом, и которое дает реактивный карбен после потери азота под действием света, что придает l -фотолейцину его свойства. Эта фотореактивная аминокислота синтезируется путем α-бромирования ази-карбоновой кислоты с последующим аминолизом ази-бром-карбоновой кислоты.
Классическая процедура синтеза фотолейцина основана на следующих этапах:
Недавно синтез фотолейцина был улучшен. Этот новый способ синтеза фотолейцина требует boc-(S)-фотолейцина, который получают путем озонолиза коммерчески доступного продукта, с последующим образованием диазирина методом Чёрча и Вайса. Этот путь предполагает значительное улучшение по сравнению с исходным шестиступенчатым синтезом (S)-фотолейцина, который протекал с низким выходом и требовал ферментативного разделения рацемического промежуточного продукта. [4]
l -Фотолейцин приобретает свою функцию после воздействия УФ- излучения. Это приводит к тому, что диазириновое кольцо l -фотолейцина теряет свои атомы азота в форме газообразного азота, оставляя свой атом углерода в качестве реактивного свободного радикала. Связи, установленные между этим углеродом, принадлежащим одному белку (A), и атомами, принадлежащими другому белку (B), отвечают за сшивающие свойства l -фотолейцина, которые позволяют ему присоединить эти две пептидные цепи в единый комплекс (AB).
Соответствующая длина волны для активации молекулы l -фотолейцина составляет от 320 до 370 нанометров. Лампы с большей мощностью более эффективны в достижении этой цели и делают это за меньшее время. Идеальная длина волны для активации аминокислоты фотолейцина составляет 345 нм.
Для повышения эффективности необходимо использовать неглубокую и непокрытую пластину. Также может потребоваться вращение образцов, расположенных под УФ-правой, чтобы обеспечить равномерное УФ-облучение и, таким образом, еще раз повысить эффективность сшивания. Если сшивание проводится in vivo, в живых клетках, они должны подвергаться воздействию УФ-излучения в течение 15 минут или меньше.
При отсутствии исходной аминокислоты ( l -лейцин ) в окружающей среде l -фотолейцин используется так же, как и его природный аналог в механизмах обработки белков клетки. Поэтому его можно использовать в качестве замены лейцина в первичной структуре белка. Это свойство фотолейцина очень полезно для изучения белок-белковых взаимодействий (PPI), поскольку молекула фотолейцина, благодаря своей молекулярной структуре, участвует в ковалентном сшивании белков в доменах белок-белкового взаимодействия (PPI), когда она активируется ультрафиолетовым ( УФ) светом. Этот факт позволяет определять и описывать стабильные и временные взаимодействия белков внутри клеток без использования каких-либо дополнительных химических сшивающих агентов, которые могли бы повредить изучаемую структуру клетки.
Изучение этих белок-белковых взаимодействий важно, поскольку они имеют решающее значение для организации клеточных процессов в пространстве и времени. Фактически, интерес к белок-белковым взаимодействиям не ограничивается только фундаментальными исследованиями: многие из этих взаимодействий, участвующих в слиянии вирусов или в передаче сигналов факторов роста, являются перспективными целями для противовирусных и противораковых препаратов. Фотоаффинная маркировка является мощным инструментом для идентификации белковых мишеней биологически активных малых молекул и исследования структуры участков связывания лигандов, благодаря чему фотоаминокислоты, включая фотолейцин, так полезны.
Моника Суханек, Анна Радзиковска и Кристоф Тиле провели эксперимент, в котором им удалось успешно пометить белки из клеток почки обезьяны (COS7). [2]
Эти клетки выращивались в среде с высоким содержанием глюкозы, из которой был взят образец площадью 3 см² для проведения вестерн-блоттинга. При достижении примерно 70% слияния исходная среда была заменена другой, в которой отсутствовали аминокислоты метионин, лейцин, изолейцин и валин, а также феноловый красный.
Затем добавляли фотоаминокислоты до конечной концентрации 4 мМ фотолейцина и фотоизолейцина, 1,7 мМ фотометионина и культивировали в течение 22 часов. По истечении времени клетки промывали PBS и облучали УФ-излучением с помощью ртутной лампы высокого давления мощностью 200 Вт со стеклянным фильтром, который удалял длины волн менее 310 нм в течение 1–3 минут. Это не влияло на жизнеспособность клетки (которая изменялась только после 10 минут облучения). Клетка подвергалась лизису и последующему вестерн-блоттингу для анализа изолированных сшитых комплексов.
МакКиннон АЛ и др. использовали фотолейцин для маркировки белков в сырой мембранной фракции, что позволило им идентифицировать центральную часть транслокационного канала внутри мембраны, которая является целью ингибитора циклодепсипептида. [4]
Традиционно распознавание белок-белковых взаимодействий осуществлялось посредством химического сшивания, которое включало использование умеренно реактивного бифункционального реагента, обычно присоединенного к свободным аминогруппам. Однако фотохимическое сшивание гораздо более специфично из-за короткого времени жизни возбужденных промежуточных продуктов. Кроме того, фотохимическое сшивание не мешает распознаванию антител, в то время как первое мешает.
Но преимущества фотолейцина идут дальше, потому что в дополнение к множеству преимуществ он не имеет отрицательных эффектов. Например, хотя неестественные аминокислоты в целом токсичны для клеток, было доказано, что фотолейцин не оказывает существенного влияния на жизнеспособность клеток. Эти результаты были подтверждены многими экспериментами. Например, исследование с Escherichia coli -галактозидазой показало, что добавление любой из трех фотоаминокислот или их смеси не оказало влияния на активность фермента. Это помогает сделать вывод, что фотоаминокислоты нетоксичны для культивируемых клеток млекопитающих и могут, по крайней мере частично, функционально заменять их естественные формы.
Однако в настоящее время фотореактивные аминокислоты используются в сочетании с химическими сшивающими агентами для достижения максимально надежных результатов в исследованиях белок-белкового взаимодействия. [2]