В оптике фотообесцвечивание (иногда называемое выцветанием) — это фотохимическое изменение молекулы красителя или флуорофора, при котором он становится неспособным постоянно флуоресцировать. Это вызвано разрывом ковалентных связей или неспецифическими реакциями между флуорофором и окружающими молекулами. [1] [2] Такие необратимые изменения в ковалентных связях вызваны переходом флуорофоров из синглетного состояния в триплетное. Количество циклов возбуждения для достижения полного отбеливания варьируется. В микроскопии фотообесцвечивание может затруднить наблюдение флуоресцентных молекул, поскольку в конечном итоге они разрушаются под воздействием света, необходимого для стимуляции их флуоресценции. Это особенно проблематично при покадровой микроскопии .
Однако фотоотбеливание также можно использовать перед нанесением флуоресцентных молекул (в основном связанных с антителами ) в попытке погасить аутофлуоресценцию . Это может помочь улучшить соотношение сигнал/шум .
Фотообесцвечивание также можно использовать для изучения движения и/или диффузии молекул, например, с помощью FRAP , при котором движение клеточных компонентов можно подтвердить путем наблюдения восстановления флуоресценции в месте фотообесцвечивания, или методов FLIP , при которых множественные раунды фотообесцвечивания проводятся для того, чтобы можно было наблюдать распространение потери флуоресценции в клетке.
Потерю активности, вызванную фотообесцвечиванием, можно контролировать, уменьшая интенсивность или длительность воздействия света, увеличивая концентрацию флуорофоров, уменьшая частоту и, следовательно, энергию фотонов входного света или используя более надежные флуорофоры, которые менее склонны к обесцвечиванию (например, Cyanine Dyes, Alexa Fluors или DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes и другие). В разумном приближении данная молекула будет разрушена после постоянного воздействия (интенсивность излучения X время излучения X количество циклов), поскольку в постоянной среде каждый цикл поглощения-эмиссии имеет равную вероятность вызвать фотообесцвечивание.
Фотообесцвечивание является важным параметром, который необходимо учитывать при флуоресцентной визуализации одиночных молекул в биофизике в реальном времени . При интенсивности света, используемой при флуоресцентной визуализации одиночных молекул (0,1-1 кВт/см 2 в типичных экспериментальных установках), даже самые надежные флуорофоры продолжают излучать в течение 10 секунд, прежде чем фотообесцвечивание происходит за один этап. Срок службы некоторых красителей можно продлить в 10–100 раз с помощью систем поглощения кислорода (до 1000 секунд при оптимизации параметров визуализации и соотношения сигнал/шум). Например, комбинация протокатеховой кислоты (PCA) и протокатехоат-3,4-диоксигеназы (PCD) часто используется в качестве системы поглощения кислорода, что увеличивает время жизни флуоресценции более чем на минуту.
В зависимости от их конкретного химического состава молекулы могут фотообесцвечиваться после поглощения всего нескольких фотонов, в то время как более устойчивые молекулы могут подвергаться множеству циклов поглощения/эмиссии перед разрушением:
Такое использование термина «время жизни» не следует путать со «временем жизни», измеренным с помощью флуоресцентной визуализации времени жизни .