stringtranslate.com

Точечный тест (лишай)

Точечный тест в лихенологии — это точечный анализ, используемый для идентификации лишайников . Он выполняется путем помещения капли химического реагента на различные части лишайника и отмечая изменение цвета (или его отсутствие), связанное с применением химического вещества. Тесты обычно встречаются в дихотомических ключах для видов лишайников, и они используют широкий спектр лишайниковых продуктов ( вторичных метаболитов ), производимых лишайниками, и их уникальность среди таксонов . Таким образом, точечные тесты показывают наличие или отсутствие химических веществ в различных частях лишайника. Они были впервые предложены в качестве метода для помощи в идентификации видов финским лихенологом Уильямом Нюландером в 1866 году. [1]

Три распространенных точечных теста используют либо 10% водный раствор KOH (тест K), насыщенный водный раствор отбеливателя или гипохлорита кальция (тест C), либо 5% спиртовой раствор p -фенилендиамина (тест P). Изменения цвета происходят из-за присутствия определенных вторичных метаболитов в лишайнике. В ключевой справочной литературе по идентификации результат химических точечных тестов служит основной характеристикой для определения вида лишайника. Существует несколько других менее часто используемых точечных тестов более ограниченного применения, которые применяются в определенных ситуациях, например, для различения определенных видов. Вариации метода, включая использование фильтровальной бумаги для улучшения видимости реакций или исследование под микроскопом , учитывают различные типы лишайников и пигментации, при этом результаты обычно суммируются коротким кодом, указывающим на вещество и наблюдаемую реакцию. Другие диагностические методы, такие как воздействие ультрафиолетового (УФ) света, могут помочь идентифицировать метаболиты лишайника и различать виды, поскольку некоторые вещества флуоресцируют под УФ-излучением, помогая дифференцировать близкородственные виды.

Тесты

Точечные тесты на листоватом лишайнике Punctelia borreri , показывающие слоевище (вверху) и сердцевину (внизу). Розовато-красное изменение цвета сердцевины в тестах C и KC указывает на присутствие гирофоровой кислоты , химического признака, который помогает отличить его от похожих видов того же рода. [2]

Чаще всего для идентификации лишайников используются четыре точечных теста. [3]

К-тест

Реагентом для теста K является водный раствор гидроксида калия (KOH) (10–25%) или, в отсутствие KOH, 10% водный раствор гидроксида натрия (NaOH, щелочь), который дает почти идентичные результаты. [4] 10 % раствор KOH сохранит свою эффективность в течение примерно от 6 месяцев до года. [5] Тест зависит от образования соли и требует наличия по крайней мере одной кислотной функциональной группы в молекуле. Соединения лишайника, содержащие хинон как часть своей структуры, будут давать темно-красный или фиолетовый цвет. Примерами соединений являются пигменты, которые являются антрахинонами , нафтохинонами и терфенилхинонами . Цвета от желтого до красного получаются с тестом K и некоторыми депсидами (включая атранорин и тамноловую кислоту ), а также многими β- орцинолдепсидонами . Напротив, ксантоны , производные пульвиновой кислоты и усниновая кислота не вступают в реакцию. [4]

Некоторые распространенные и широко распространенные лишайники, имеющие лишайниковые продукты с положительной реакцией на калий, включают Xanthoria parietina , который имеет цвет K+ (красно-фиолетовый) из-за париетина (антрахинона), и Dibaeis baeomyces , который имеет цвет K+ (желтый) из-за дидепсидного соединения баеомицетиновой кислоты. [6]

тест С

В этом тесте используется насыщенный раствор гипохлорита кальция (отбеливающий порошок) или, в качестве альтернативы, разбавленный раствор (обычно используется 5,25%) гипохлорита натрия или неразбавленный бытовой отбеливатель . Эти растворы обычно заменяют ежедневно, поскольку они распадаются в течение 24–48 часов; они распадаются еще быстрее под воздействием солнечного света (менее часа), поэтому их рекомендуется хранить в темной бутылке. Другими факторами, ускоряющими разложение этих растворов, являются тепло, влажность и углекислый газ . [7]

Цвета, которые обычно наблюдаются при тесте C, — красные и оранжево-розовые. Химические вещества, вызывающие красную реакцию, включают анзиаиновую кислоту , эритрин и леканоровую кислоту , в то время как те, которые приводят к оранжево-красной реакции, включают гирофоровую кислоту. [8] Редко получается изумрудно-зеленый цвет, вызванный реакцией с дигидроксидибензофуранами , [ 9] такими как химикат стрепсилин . [8] Другой редкий цвет, получаемый при этом тесте, — желтый, который наблюдается у Cladonia portentosa в результате дибензофурана усниновой кислоты. [10]

Некоторые распространенные и широко распространенные лишайники, имеющие лишайниковые продукты с положительной реакцией на C, включают Lecanora expallens , который имеет C+ (оранжевый) из-за ксантоновой тиофановой кислоты, и Diploschistes muscorum , который имеет C+ (красный) из-за дидепсида диплосхистезовой кислоты. [10]

тест PD

п- фенилендиамин

Это также известно как тест P. Он использует 1–5% этанольный раствор парафенилендиамина ( PD ), приготовленный путем помещения капли этанола (70–95%) на несколько кристаллов химического вещества; это дает нестабильный, светочувствительный раствор, который сохраняется около дня. [11] Альтернативная форма этого раствора, называемая раствором Штайнера, гораздо более стойкая, хотя она производит менее интенсивные цветные реакции. Обычно ее готовят путем растворения 1 грамма PD, 10 граммов сульфита натрия и 0,5 миллилитра моющего средства в 100 миллилитрах воды; изначально розовый по цвету раствор становится фиолетовым со временем. Раствор Штайнера будет сохраняться в течение месяцев. [5] Фенилендиамин реагирует с альдегидами , давая основания Шиффа в соответствии со следующей реакцией: [9]

R-CHO + H 2 N-C 6 H 4 -NH 2 → R-CH=N-C 6 H 4 -NH 2 + H 2 O

Продукты этой реакции имеют цвет от желтого до красного. Большинство β-орцинолдепсидонов и некоторые β-орцинолдепсиды будут реагировать положительно. [11] Тест PD, известный своей высокой специфичностью к веществам, которые дают желтые или красные реакции K+, в значительной степени заменил более простой, но менее убедительный тест K. [12] PD ядовит как в виде порошка, так и в виде раствора, и поверхности, которые соприкасаются с ним (включая кожу), обесцвечиваются. [13]

Некоторые распространенные и широко распространенные лишайники, имеющие лишайниковые продукты с положительной реакцией на P, включают Parmelia subrudecta , которая является PD+ (желтой) из-за дидепсида атранорина, и Hypogymnia physodes , которая является PD+ (оранжевой) из-за депсидона физодаловой кислоты. [14]

тест КС

Этот точечный тест можно выполнить, смочив слоевище K, а затем сразу C. Первоначальное применение K разрушает (посредством гидролиза ) эфирные связи в депсидах и депсидонах. Если высвобождается фенольная гидроксильная группа, которая находится в мета-положении к другому гидроксилу, то при применении C образуется красно-оранжевый цвет. [15] Алектороновая кислота и физодовая кислота дают этот цвет, в то время как фиолетовый цвет получается при наличии пикролихеновой кислоты. Тест CK является менее часто используемым вариантом, который меняет порядок нанесения химикатов. Он используется в особых случаях при тестировании на оранжевый цвет, производимый барбатовой кислотой или дифрактаиновой кислотой , например, присутствующей в Cladonia floerkeana . [8] Йод Люголя является еще одним реагентом, который может быть полезен для идентификации определенных видов. [16]

Hypogymnia tubulosa — лишайник, имеющий KC+ (оранжево-розовый) цвет из-за депсидона физодовой кислоты; Cetrelia olivetorum имеет KC+ ​​(розово-красный) цвет из-за депсидона алектороновой кислоты. [10]

Менее распространенные тесты

Существует несколько точечных тестов, которые используются редко из-за их ограниченной применимости, но могут быть полезны в ситуациях, когда необходимо обнаружить определенные метаболиты лишайников или различить определенные виды, когда другие тесты дают отрицательные результаты.

Проведение выборочных тестов

Химические точечные тесты на корковый и саксиколизный лишай Aspicilia epiglypta

Точечные тесты проводятся путем помещения небольшого количества желаемого реагента на часть лишайника, которая должна быть протестирована. Часто тестируются как кора , так и сердцевина лишайника, и иногда полезно тестировать другие структуры, такие как соралии . Один из методов заключается в том, чтобы набрать небольшое количество химиката в стеклянный капилляр и коснуться им слоевища лишайника; для этой цели также используется небольшая кисточка. Реакции лучше всего визуализировать с помощью лупы или стереомикроскопа . [8] Лезвие бритвы можно использовать для удаления коры и доступа к сердцевине. В качестве альтернативы раствор можно наносить на лишайниковые особенности, у которых отсутствует кора или которые оставляют сердцевину открытой, такие как соралии, псевдоцифеллы или нижняя сторона чешуек. [19]

В вариации этой техники, предложенной шведским химиком Йоханом Сантессоном, [20] используется кусок фильтровальной бумаги , чтобы попытаться сделать цветную реакцию более заметной. Фрагмент лишайника прижимается к бумаге, и лишайниковые вещества извлекаются 10–20 каплями ацетона. После испарения ацетона лишайниковые вещества остаются на бумаге в кольце вокруг фрагмента лишайника. Затем фильтровальную бумагу можно протестировать обычным способом. [21] В случаях, когда результаты точечного теста на талломе неопределенны, можно раздавить тонкий срез ткани на предметном стекле микроскопа в минимальном количестве воды и реагента под покровным стеклом. Изменение цвета видно под маломощным объективом микроскопа или когда предметное стекло помещают на белый фон. [8] Этот метод полезен при тестировании лишайников с темными пигментами, таких как Bryoria . [5]

Капельные тесты могут использоваться по отдельности или в комбинации. Результаты капельных тестов обычно представлены в виде короткого кода, который включает в себя, по порядку, (1) букву, указывающую на используемый реагент, (2) знак «+» или «−», указывающий на изменение цвета или отсутствие изменения цвета, соответственно, и (3) букву или слово, указывающие на наблюдаемый цвет. Кроме того, следует проявлять осторожность, указывая, какая часть лишайника была протестирована. Например, «Кора K+ оранжевый, C−, P−» означает, что кора тестируемого образца стала оранжевой при нанесении KOH и не изменилась под действием отбеливателя или пара -фенилендиамина. Аналогично, «Медулла K−, KC+R» будет указывать на то, что мозговое вещество лишайника было нечувствительно к нанесению KOH, но нанесение KOH с последующим немедленным отбеливателем привело к тому, что мозговое вещество стало красным. [12]

Иногда требуется некоторое время для развития цветной реакции. Например, у некоторых видов Cladonia реакция PD с фумарпротоцетраровой кислотой может занять до полуминуты. [13] Напротив, реакции с C и KC обычно мимолетны и происходят в течение секунды после нанесения реагента, поэтому изменение цвета можно легко пропустить. Существует несколько возможных причин, по которым ожидаемый результат теста не появляется. Причины включают старые и химически неактивные реагенты и низкие концентрации лишайниковых веществ в образце. Если цвет таллома темный, изменение цвета может быть скрыто, и другие методы являются более подходящими, например, метод фильтровальной бумаги. [8]

Другие тесты

Крупным планом вид поверхности лишайника, на которой видны две желтовато-зеленые чашеобразные структуры на неровной поверхности.
Освещенные ультрафиолетом слоевище и апотеции коркового лишайника Ochrolechia africana ; желтоватый цвет обусловлен флуоресценцией лигексантона. [22]

Иногда может быть полезно выполнять другие диагностические меры в дополнение к точечным тестам. Например, некоторые метаболиты лишайника флуоресцируют под действием ультрафиолетового излучения , так что воздействие источника УФ-излучения на определенные части лишайника может выявить наличие или отсутствие этих метаболитов аналогично точечным тестам. Примерами лишайниковых веществ, которые дают яркую флуоресценцию в УФ-излучении, являются алектороновая, лобаровая и диварикатовая кислоты, а также лигексантон . В некоторых случаях тест на УФ-излучение может использоваться для различения близкородственных видов, таких как Cladonia deformis (УФ-) и Cladonia sulphurina (УФ-+, из-за присутствия скваматовой кислоты). [19] Только длинноволновое УФ-излучение полезно для непосредственного наблюдения за лишайниками. [5]

Более продвинутые аналитические методы, такие как тонкослойная хроматография , высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия, также могут быть полезны для первоначальной характеристики химического состава лишайников или в случаях, когда точечные тесты не дают результатов. [23]

История

Финский лихенолог Уильям Ниландер , как правило, считается первым, кто продемонстрировал использование химических веществ для идентификации лишайников. [24] В работах, опубликованных в 1866 году, он предложил точечные тесты с использованием KOH и отбеливающего порошка для получения характерных цветных реакций — обычно желтого, красного или зеленого. [1] [25] [26] В этих исследованиях он показал, например, что лишайники, ныне известные как Cetrelia cetrarioides и C. olivetorum, можно различить как отдельные виды из-за их различных цветовых реакций: C+ красный у последнего, в отличие от отсутствия реакции у первого. Ниландер показал, как KOH можно использовать для различения похожих Xanthoria candelaria и Candelaria concolor, потому что присутствие париетина у первого вида приводит к сильной цветовой реакции. Он также знал, что в некоторых случаях химические вещества лишайника не были равномерно распределены по коре и мозговому веществу из-за различных цветовых реакций на этих участках. [24] В середине 1930-х годов Ясухико Асахина создал тест с пара -фенилендиамином, который дает реакции от желтого до красного цвета со вторичными метаболитами, имеющими свободную альдегидную группу. [27] [28] Позднее было показано, что этот точечный тест особенно полезен в таксономии семейства Cladoniaceae . [29] [24]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Nylander, William (ноябрь 1866 г.). «Гипохлорит извести и гидрат калия, два новых критерия в изучении лишайников». Журнал Лондонского Линнеевского общества, Ботаника . 9 (38): 358–365. doi :10.1111/j.1095-8339.1866.tb01301.x.
  2. ^ Truong, Camille; Clerc, Philippe (2003). «Группа Parmelia borreri (лихенизированные аскомицеты) в Швейцарии». Botanica Helvetica . 113 (1): 49–61.
  3. ^ МакКьюн, Брюс ; Гейзер, Линда (1997). Макролишены Тихоокеанского Северо-Запада (2-е изд.). Корваллис: Издательство Университета штата Орегон. стр. 347–349. ISBN 0-87071-394-9.
  4. ^ аб Ахмаджян и Хейл 1973, стр. 636.
  5. ^ abcde Шарнофф, Стивен (2014). Полевой справочник по лишайникам Калифорнии . Нью-Хейвен: Издательство Йельского университета. С. 369–371. ISBN 978-0-300-19500-2. OCLC  862053107.
  6. ↑ Оранж, Джеймс и Уайт 2001, стр. 15.
  7. ^ Ахмаджян и Хейл 1973, с. 635.
  8. ^ abcdef Уокер, Ф. Дж.; Джеймс, П. В. (май 1980 г.). «Пересмотренное руководство по микрохимическим методам идентификации лишайниковых продуктов». Бюллетень Британского общества по изучению лишайников . 46 (Приложение): 13–29.
  9. ^ аб Ле Погам, Пьер; Эрбетта, Гаэтан; Бусти, Жоэль (19 декабря 2014 г.). «Анализ метаболитов лишайника, различные подходы». Последние достижения лихенологии . Нью-Дели: Springer India. стр. 229–261. дои : 10.1007/978-81-322-2181-4_11. ISBN 978-81-322-2180-7.
  10. ^ abc Orange, James & White 2001, стр. 16.
  11. ^ аб Ахмаджян и Хейл 1973, стр. 636–637.
  12. ^ ab Hale, Mason (1974). Биология лишайников (2-е изд.). Лондон: Edward Arnold. стр. 119–121. ISBN 978-0-7131-2456-9.
  13. ^ ab Dahl & Krog 1973, стр. 23.
  14. ↑ Оранж, Джеймс и Уайт 2001, стр. 17.
  15. ^ Ахмаджян и Хейл 1973, с. 637.
  16. ^ Бродо, Ирвин М .; Шарнофф, Сильвия Дюран; Шарнофф, Стивен (2001). Лишайники Северной Америки . Нью-Хейвен, Коннектикут [ua]: Издательство Йельского университета. стр. 103–108. ISBN 978-0300082494.
  17. ↑ Оранж, Джеймс и Уайт 2001, стр. 9.
  18. ^ ab Alphandary, Elisa; McCune, Bruce (2013). «Новый химический точечный тест на мирихидовую кислоту». The Lichenologist . 45 (5): 697–699. doi :10.1017/s0024282913000418.
  19. ^ ab Dahl & Krog 1973, стр. 24.
  20. ^ Сантессон, Иоганн (1967). «Химические исследования на лишайниках. 4. Тонкослойная хроматография лишайниковых веществ» (PDF) . Acta Chemica Scandinavica . 21 : 1162–1172. doi : 10.3891/acta.chem.scand.21-1162 .
  21. ^ Ахмаджян и Хейл 1973, с. 634.
  22. ^ Бродо, Ирвин М. (1991). «Исследования рода лишайников Ochrolechia . 2. Кортикальные виды Северной Америки». Канадский журнал ботаники . 69 (4): 733–772. doi :10.1139/b91-099.
  23. ^ "Гербарий лишайников Университета штата Аризона: Lichen TLC". nhc.asu.edu . Получено 18 сентября 2016 г. .
  24. ^ abc Vitikainen, Orvo (2001). «Вильям Нюландер (1822–1899) и хемотаксономия лишайников». The Bryologist . 104 (2): 263–267. doi :10.1639/0007-2745(2001)104[0263:WNALC]2.0.CO;2. JSTOR  3244891.
  25. ^ Нюландер, В. (1866). «Circa novum in studio lichenum criterium chemicum» [Новый химический критерий в изучении лишайников]. Флора (на латыни). 49 : 198–201.
  26. ^ Нюландер, В. (1866). «Quaedam addenda ad nova Criteria Chemica в студийном лишайнике» [Новые критерии, которые будут добавлены к химическому изучению лишайников]. Флора (на латыни). 49 : 233–234.
  27. ^ Асахина, Ю. (1934). «Über die Reaktion vom Flechten-Thallus» [Об ответе слоевища лишайника]. Acta Phytochimica (на немецком языке). 8 : 47–64.
  28. ^ Асахина, Ю. (1936). «Mikrochemischer Nachweis der Flechtenstoffe (I)» [Микрохимическое обнаружение лишайниковых веществ (I)]. Журнал японской ботаники (на немецком языке). 12 : 516–525.
  29. ^ Торрей, Рэймонд Х. (1935). «Парафенилендиамин, новый цветовой тест для лишайников». Torreya . 35 (4): 110–112. JSTOR  40597010.

Цитируемая литература