Микротехника — совокупность методов, используемых для подготовки микрообъектов к изучению. [1] В настоящее время она применяется во многих областях естественных наук. Двумя известными ветвями микротехники являются ботаническая (растительная) микротехника и зоологическая (животная) микротехника.
Что касается как растительной микротехники, так и животной микротехники, в недавних микроэкспериментах обычно используются четыре типа методов: целые препараты, мазки, давления и срезы. [2] Растительная микротехника включает прямые макроскопические исследования, срезы, выполненные от руки, очистку, мацерацию, заливку и окрашивание. [3] Кроме того, в зоологических микронаблюдениях используются три способа подготовки: парафиновый метод, целлоидиновый метод и метод замораживания. [4]
Раннее развитие микротехники в ботанике тесно связано с развитием микротехники в зоологии. Зоологические и ботанические открытия принимаются как зоологами, так и ботаниками. [5]
Область микротехники существовала с конца 1930-х годов, когда появился принцип сухого препарирования. [6] Раннее развитие микротехники в ботанике тесно связано с развитием зоологии. Зоологические и ботанические открытия принимаются как зоологами, так и ботаниками. [5] С тех пор как Гук открыл клетки, микротехника также развивалась с появлением первых микроскопов. Затем микротехника продвинулась в период 1800–1875 годов. [6] После 1875 года появились современные микрометоды. В последние годы как традиционные методы, так и современная микротехника использовались во многих экспериментах. [3]
Некоторые общие микротехники могут использоваться как при микронаблюдении за растениями, так и за животными. Целые препараты, мазки, давленые препараты и срезы — четыре широко используемых метода при подготовке образцов растений и животных для определенных целей. [2]
Целые препараты обычно используются, когда наблюдателям необходимо использовать целый организм или провести детальное исследование структуры конкретного органа. [7] Для этого метода требуются объекты, из которых можно удалить влагу, например семена и микроокаменелости. [2]
В зависимости от назначения, препараты можно разделить на три категории: временные препараты, полупостоянные препараты и постоянные препараты. Временные препараты обычно используются для обучения в классе. [8] Полупостоянные препараты готовятся для более длительного использования, которое составляет не более четырнадцати дней. При такой подготовке для герметизации образцов используется канадский бальзам, и этот метод используется для наблюдения за одноклеточными и колониальными водорослями, спорами грибов, протонематами мхов и проталлиусами. Третий способ — постоянный препарат. [8] Обычно используются два метода: метод гигробутола и метод глицерина - ксилола . [9]
Мазки — это простой способ приготовления срезов. Этот метод используется во многих лабораториях. [10] Мазки можно использовать при изготовлении образцов для слайдов, равномерно распределяя жидкие или полужидкие материалы или свободные ткани и клетки животных и растений на слайде. [10] Этапы и требования для применения метода мазков следующие: сначала мазок. Когда твердый материал размазан, материал следует поместить на предметное стекло и вытереть, затем использовать лезвие, чтобы прижать материал с одной стороны. [11] Клетки следует выдавить и равномерно распределить на предметном стекле тонким слоем, например, размазанный пыльник. [10]
Методы давления — это методы, при которых объекты сдавливаются с силой. Этот метод подходит для подготовки как прозрачных, так и нежных тканей. [12] При подготовке слайдов давления образцы должны быть тонкими и прозрачными, чтобы объекты можно было четко наблюдать под микроскопом. [12]
Этот метод заключается в том, чтобы поместить материал на предметное стекло и удалить его скальпелем или препаровальной иглой, затем добавить каплю раствора красителя. [2] После этих шагов наложите второй предметный стекло, чтобы закрыть первый предметный стекло, и равномерно надавите, чтобы разбить материал и рассеять клетки. [12] Кроме того, для подготовки предметных стекол можно использовать другой возможный способ. Образцы также можно выдавливать между покровным стеклом и предметным стеклом с одинаковым давлением. [12]
Срезы известны как тонкие срезы, которые необходимо тестировать во всех исследованиях клеточных структур. [13] Этот метод можно использовать для подготовки тканей животных и растений. [14] Для использования под оптической микроскопией толщина материала должна быть от 2 до 25 микрометров. При наблюдении под электронной микроскопией срезы должны быть от 20 до 30 нанометров. [2] Микротом можно использовать для получения срезов достаточно тонких срезов. Если объекты не могут удовлетворить требованиям толщины, материалы необходимо обезвоживать с помощью спирта перед получением среза. [12] Три наиболее часто используемых метода получения срезов — это метод ручного сечения, парафиновый метод и целлоидиновый метод.
Ботаническая микротехника представляет собой совокупность методов, обеспечивающих микровизуализацию гена и генного продукта во всем растении. [15] Растительная микротехника также является исследованием, предоставляющим ценную экспериментальную информацию. [3] Растительная микротехника включает классические методы, разработанные более ста лет назад, и новые методы, разработанные для расширения сферы наших исследований и глубины ботанических микроисследований. [15] Как традиционная, так и новая микротехника полезны для экспериментальных исследований, и некоторые из них окажут значительное влияние на дальнейшее изучение. [3] Для подготовки образцов растений используются различные методы, включая прямые макроскопические исследования, срезы от руки, [16] очистку, мацерацию, заливку и окрашивание.
Прямое микроисследование — это простой способ, подготовленный для наблюдения за микрообъектами. Также этот метод полезен для наблюдения за тем, растет ли плесень на поверхности образцов. Это может быть начальным этапом микроэксперимента. [17]
Свободная нарезка — это метод изготовления тонких срезов свежих или фиксированных экспериментальных материалов с помощью ручного лезвия . [18] Свободная нарезка относится к методу прямой нарезки свежих или фиксированных материалов (обычно растений с низкой степенью одревеснения) на тонкие срезы без специальных инструментов или специальных химических реагентов. [16]
Метод очистки обеспечивает получение полупрозрачных слайдов путем удаления части цитоплазматического содержимого и последующего применения реагентов с высоким показателем преломления для обработки тканей. [2] Этот метод подходит для подготовки целых слайдов. Очистка представляет собой процедуру использования очищающих реагентов для удаления спирта и делает ткань полупрозрачной. [19] Ксилол является наиболее популярным очищающим агентом. [20] [21]
Мацерация тканей — это процесс разделения составляющих клеток тканей. Этот метод позволяет наблюдателям изучать целую клетку в трехмерных деталях. [8] Метод химической мацерации означает использование химикатов для обработки органов или частей с целью размягчения ткани и растворения клеток, чтобы можно было идентифицировать различные клетки. [8]
Техника заливки является средней стадией при выполнении процесса секционирования. [13] При подготовке образцов сложно сделать однородные срезы, так как ткань мягкая. [22] Поэтому необходимо пропитать ткань определенным веществом, чтобы затвердеть всей ткани, чтобы облегчить нарезку. Этот процесс называется заливкой. [22] Вещество, используемое для заливки ткани, — это заливочная среда, выбор которой зависит от категории микроскопа, категории микротома и категории ткани. [23] Для заливки обычно используют парафин, температура плавления которого составляет от 56 до 62 °C. [22]
Поскольку немногие растительные ткани имеют цвет, между растительными тканями существует небольшая хроматическая разница, что затрудняет дифференциацию ботанической структуры. [24] Материал обычно окрашивается перед установкой. Этот процесс называется окрашиванием, его можно использовать для подготовки ботанических образцов, чтобы можно было отличить одну часть образца от другой с точки зрения цвета. [2] Кислотные красители можно использовать при окрашивании микропрепаратов, например, кислотные красители используются при окрашивании ядер, а другие клеточные компоненты окрашиваются щелочью. [2] Существуют также красильные машины, используемые для окрашивания, которые позволяют автоматически окрашивать ткани. [25]
Зоологическая микротехника — это искусство подготовки к микроскопическому наблюдению за животными. Хотя многие микротехники могут использоваться как в растительных, так и в животных микроэкспериментах. Некоторые методы могут отличаться от самих себя при использовании в разных областях. Можно выделить три наиболее часто используемых способа подготовки, используемых в зоологических микронаблюдениях: парафиновый метод, целлоидиновый метод, метод замораживания и смешанные методы. [4]
Этот процесс обычно состоит из этапов инфильтрации, заливки, секционирования, прикрепления и обработки срезов. [26] После начального этапа, фиксации, следующим шагом является дегидратация, которая удаляет воду из ткани с помощью спирта. [27] Затем ткань может быть инфильтрована и залита воском. Образец ткани может храниться в течение нескольких лет после завершения заливки этой ткани в воск. [27] Парафиновый воск , который является мягким и бесцветным, является наиболее часто используемым реагентом. [28]
Для разрезания ткани в качестве режущего лезвия можно использовать как микротомный нож, так и лезвие бритвы. [4]
Микротомный нож используется для обработки срезов. Необходимо использовать микротомный нож при подготовке срезов менее 1/1000 микрометра. [29] При использовании такого ножа операторы должны быть чрезвычайно осторожны. Этот инструмент иногда непрактичен, поэтому для общей работы по подготовке срезов более 9 микрометров используют лезвие бритвы (1 микрометр равен 1/1000 микрометра). [29] Кроме того, лезвие бритвы работает лучше, чем микротомный нож, когда требуются толстые срезы не менее 20 микрометров. [4]
После разрезания подготовленные срезы прикрепляются к предметным стеклам. Существует два наиболее часто используемых аффиксатора: Хаупта и Майера. [30] Аффиксатор Хаупта содержит 100 кубических сантиметров дистиллированной воды, 1 г желатина, 2 г кристаллов фенола, 15 кубических сантиметров глицерина. Аффиксатор Майера состоит из 5 кубических сантиметров яичного альбумина, 50 кубических сантиметров глицерина, 1 г салициловой кислоты натрия. [31] Общие этапы прикрепления парафиновых срезов можно свести к следующему: 1. Очистите требуемые слайды, 2. Отметьте очищенные слайды, 3. Нанесите аффиксатор на каждый слайд, 4. Поместите на другой слайд, 5. Распределите аффиксатор, 6. Нанесите плавающую среду, 7. Разделите парафин на требуемую длину, 8. Перенесите срезы, 9. Добавьте больше плавающей среды, если происходит неполное плавание, 10. Повысьте температуру, 11. Удалите слайды и лишнюю плавающую среду, 12. Высушите срез. [4]
Обработка парафиновых срезов включает в себя 1. Депарафинирование, 2. Удаление депарафинирующего раствора, 3. Гидратацию, 4. Окрашивание, 5. Дегидратацию, 6. Деалкоголизацию и очистку, 7. Монтаж покровного стекла. [4]
Целлоидиновая техника — это процедура заливки образца в целлоидин. [32] Этот метод можно использовать для заливки больших твердых объектов. [33] Целлоидин — это пищеварительное волокно, которое легко воспламеняется и растворяется в ацетоне, гвоздичном масле и смеси безводного спирта и эфира. [34] Целлоидин превратится в белую эмульсионную мутную жидкость при контакте с водой, поэтому для хранения целлоидина необходимо использовать сухую емкость. [33]
Метод нарезки целлоидином заключается в фиксации и обезвоживании ткани, а затем в обработке ее безводной спирто-эфирной смесью. После этого шага ткань пропитывается, заливается и нарезается целлоидином. [35] Более того, этот метод нарезки может нарезать большие ткани и имеет то преимущество, что его тепло не дает тканям сжиматься. Однако эта техника имеет некоторые недостатки. Например, срезы нельзя нарезать очень тонкими (более 20 микрон), а пропитка целлоидином занимает много времени. [36]
Метод замораживания является наиболее часто используемым методом секционирования. [37] Этот метод может хорошо сохранять иммунную активность различных антигенов . Как свежая ткань, так и фиксированная ткань могут быть заморожены. Более того, этот метод также используется для замораживания срезов как свежих, так и фиксированных растительных тканей. [38]
Во время процедуры замораживания вода в тканях легко образует кристаллы льда, что часто влияет на локализацию антигена. [37] Обычно считается, что когда кристаллы льда малы, эффект невелик, а когда кристаллы льда велик, повреждение структуры ткани велико, и вышеуказанное явление более вероятно произойдет в тканях с большим количеством компонентов влаги. [39] Размер кристалла льда прямо пропорционален скорости его роста и обратно пропорционален скорости зародышеобразования (скорости образования), то есть чем больше количество образованных кристаллов льда, тем он меньше и тем серьезнее воздействие на структуру. [40] Поэтому количество кристаллов льда должно быть сведено к минимуму. Метод замораживания позволяет быстро делать срезы тканей и биопсию без использования реагентов. Эта процедура должна быть быстрой в случае формы кристалла льда. [39]
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ){{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: Цитировать журнал требует |journal=( помощь )