Инсулинрегулируемая аминопептидаза (IRAP) — это белок , который у людей кодируется геном лейцил- и цистиниламинопептидазы ( LNPEP ) . IRAP — это трансмембранный белок II типа , который принадлежит к подсемейству окситоциназ аминопептидаз M1 , наряду с ERAP1 и ERAP2 . Он также известен как окситоциназа, лейцил- и цистиниламинопептидаза, плацентарная лейцинаминопептидаза (P-LAP), цистиниламинопептидаза (CAP) и вазопрессиназа. IRAP экспрессируется в разных типах клеток, в основном локализуется в специализированных регулируемых эндосомах , которые могут быть привлечены на поверхность клетки при активации рецептора, специфичного для типа клетки.
Функции IRAP зависят от типа клеток и внеклеточной среды. Например, в адипоцитах и мышечных клетках IRAP является основным компонентом пузырьков хранения Glut4 (GSV) и регулирует перемещение GSV в ответ на сигнализацию рецептора инсулина . Изменение набора IRAP на поверхности клетки, как это наблюдается при диабете 2 типа , нарушает усвоение глюкозы, блокируя перемещение транспортера глюкозы типа 4 (Glut4) на клеточной мембране. Это доказательство лежит в основе центральной функции аминопептидазы при этом заболевании. [5]
IRAP расщепляет несколько гормонов, вазоактивных пептидов и нейропептидов, таких как окситоцин , соматостатин , холецистокинин , ангиотензин III (Ang), Lys-брадикинин , аргинин-вазопрессин , Met- и Leu-энкефалин , нейрокинин A и динорфин A. [ 6] Большинство из них имеют основные функции в развитии неврологических расстройств, включая шизофрению и нарушения памяти . [7] Кроме того, изменение уровней нейропептидов из-за нарушения регуляции IRAP, по-видимому, является одним из механизмов, влияющих на процессы обучения и познания, что подчеркивает фундаментальную функцию IRAP также при нарушениях памяти. [8]
В мозге IRAP является основным рецептором Ang IV, важнейшего компонента ренин-ангиотензиновой системы , который, как было показано, оказывает нейропротекторное действие. [9] [10] Эти данные побудили провести исследования по разработке аналогов с высокой селективностью IRAP, которые демонстрируют потенциал в улучшении памяти, сосудистой регуляции и противосудорожном/противоэпилептогенном действии. [11] [12] Эти аналоги изучались при нейродегенеративных заболеваниях , демонстрируя улучшенную стабильность и проникновение в мозг, сильное связывающее сродство с целевыми рецепторами и положительное влияние на когнитивную функцию и нейропротекцию в моделях животных. [13] Также было обнаружено, что ингибиторы IRAP противодействуют вазоконстрикции, вызванной ацетилхолином in vivo , что подчеркивает роль IRAP в модулировании сосудистой функции. [14] Удаление IRAP снижает восприимчивость к судорогам, вызванным пентилентетразолом , у мышей, что предполагает его потенциал в качестве терапевтической цели при эпилепсии.
IRAP играет важную роль в регуляции иммунной системы. Подобно ERAP1 и ERAP2, IRAP способен обрезать N-конец антигенных пептидов, уменьшая их длину до 8-10 аминокислот, оптимальной длины для связывания MHC класса I. В отличие от ERAP1 и ERAP2, нет никаких доказательств опосредованного IRAP обрезания антигенных пептидов в эндоплазматическом ретикулуме для презентации MHC-I через прямой путь. С другой стороны, IRAP имеет основную функцию в кросс-презентации . Здесь аминопептидаза обрезает кросс-презентированные пептиды в определенном эндосомальном компартменте, описанном в дендритных клетках , [15] перед их загрузкой на IRAP-ассоциированные молекулы MHC класса I.
IRAP стабилизирует определенный тип регулируемых ранних эндосом, в которых он находится. Стабильность этих эндосом необходима для пути кросс-презентации в дендритных клетках и регулирует несколько эндосомальных сигнальных путей ( TCR , TLR9 , TNFα , IL-6 ) в других типах иммунных клеток. В Т-клетках IRAP регулирует трафик цепей TCD3ζ, которые привлекаются к внутриклеточным везикулам IRAP, а также эндосомальную сигнализацию комплексом TCR. [16] Истощение IRAP увеличивает уровни TCR на поверхности клетки, которые, однако, демонстрируют дефектную сигнализацию. Другие исследования показали, что IRAP регулирует активацию Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), задерживая созревание эндосом, содержащих TLR9, в лизосомы и ограничивая, как следствие, расщепление и активацию TLR9. [17] Наконец, IRAP играет важную роль в секреции провоспалительных цитокинов TNFa и IL-6 тучными клетками . При отсутствии IRAP нарушается транспортировка везикул, содержащих TNFa и IL-6, из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану. [18]
IRAP кодируется геном LNPEP (лейцил- и цистиниламинопептидаза), расположенным на хромосоме 5q15. Этот ген имеет длину ~75 кб и состоит из 18 экзонов и 17 интронов. [19] Согласно ensembl.org, LNPEP имеет 5 транскриптов, но только одну основную экспрессируемую изоформу (NM_005575.3).
Среди различных генетических вариантов, выявленных до сих пор, несколько вариантов отдельных нуклеотидов были связаны с заболеваниями. Подавляющее большинство вариантов отдельных нуклеотидов в LNPEP являются интронными вариантами, которые являются частью расширенного гаплотипа, который функционирует как транскрипционный усилитель соседнего гена ERAP2, но не регулирует экспрессию LNPEP . Фактически, по сравнению с членами семейства M1-аминопептидаз ERAP1 и ERAP2, LNPEP демонстрирует низкую толерантность к генетической вариации, укорачивающей белок, и содержит мало вариантов потери функции в своем гене. [20]
LNPEP имеет пять распространенных (>1% в GnomAD) миссенс-вариантов , из которых наиболее распространенный rs2303138, приводящий к замене аминокислоты (Ala763Thr), был связан с риском псориаза и анкилозирующего спондилита . [21] [22] Точная роль IRAP в этих состояниях остается неизвестной, но, учитывая его участие в активации адаптивных и врожденных иммунных реакций, ренин-ангиотензиновой системы (РАС) и метаболизме глюкозы, эти генетические варианты могут оказывать плейотропное воздействие на иммунную, кровеносную и метаболическую системы. [23] Два других распространенных миссенс-варианта rs41276279 (p.Val373Ile) и rs11746232 (p.Ile963Val) умеренно коррелируют с уровнями экспрессии гена LNPEP (ссылка на gtexportal.org), но до сих пор не были связаны с заболеванием.
Ген IRAP человека кодирует трансмембранный белок II типа, состоящий из трех отдельных доменов: N-концевого цитоплазматического домена, содержащего 109 аминокислот, трансмембранного домена из 23 аминокислот и внутрипросветного (или внеклеточного) домена, состоящего из 893 аминокислот. [24] Внутриэндосомальный домен C-конца несет в себе мотив связывания Zn, известный как HEXXH(X)18E, а также мотив экзопептидазы GAMEN. Эти два мотива также присутствуют в ERAP1 и ERAP2 и являются общими для всех членов семейства аминопептидаз M1. C-концевой домен был кристаллизован в виде димера, каждый мономер состоит из четырех непрерывных доменов и образует закрытую полую структуру с активным сайтом в его центре. Домен I (остатки 171–365) образует обширный β-сэндвич с семицепочечным β-седлом, фланкированным с обеих сторон трех- и четырехцепочечными β-слоями. Домен II (остатки 366–615) содержит каталитический сайт с ионом Zn в его центре. Каталитический ион Zn координируется His464, His468 и Glu487 цинксвязывающего мотива HEXXH(X)18-E. Домен III (остатки 616–704) принимает складку β-сэндвича, состоящую из трех- и четырехцепочечных β-слоев, и образует мост между доменами II и IV. Домен IV (остатки 705–1025) состоит из α-спиралей и собирается в «чашеобразную» форму. Активный сайт IRAP закрыт доменом IV, образуя большую, в основном закрытую полость, прилегающую к иону Zn. [25]
IRAP1 использует каталитический механизм, аналогичный предложенному для гидролазы LTA4. Он принимает термолизин-подобную складчатость и кристаллизуется в двух различных конформациях: открытой и закрытой (рисунок 1). [25] [26] IRAP является единственной задокументированной аминопептидазой M1, которая может расщеплять циклические пептиды, такие как вазопрессин и окситоцин. Отличительная конфигурация мотива GAMEN в IRAP создает дополнительное пространство вокруг остатков 3 и 4 связанного линейного пептида, которое может использоваться для размещения более объемных боковых цепей, возможно, обеспечивая более широкую селективность для пептидов. [26] Атомные взаимодействия между лигандом и IRAP могут способствовать конформационному закрытию. Открытая конформация отвечает за начальный захват субстрата, который может вызывать дальнейшее закрытие, что усиливает взаимодействия и облегчает катализ. Структура IRAP/лиганд-связанная имеет существенные отличия по сравнению с «открытой» структурой и структурой IRAP/пептид. [27] Было обнаружено, что домен IV сопоставлен с доменами I/II, что приводит к полному исключению внутренней полости из внешнего растворителя. Недавно была решена кристаллическая структура IRAP с макроциклическим пептидным ингибитором, что позволило выявить несколько ключевых особенностей механизма ингибирования. Тесное сопоставление петли GAMEN на связанном ингибиторе не оставляет места для движения молекул воды для взаимодействия с ионизированным карбоксилатом остатка активного центра Glu (Glu465). В качестве механизма ингибирования была предложена синергия двух механизмов: стабилизации закрытой конформации и исключения каталитической воды плотно сопоставленной петлей GAMEN. [28] Более того, аминопептидазы M1 используют остаток тирозина в активном центре для стабилизации переходного состояния. В случае IRAP каталитический Tyr549 находится в разных ориентациях в открытой и закрытой конформациях. Например, в случае фосфиновых псевдопептидных ингибиторов, которые имитируют переходное состояние пептидных субстратов, Tyr549 изменяет ориентацию при связывании лиганда, взаимодействуя с одним из атомов кислорода фосфиновой группы, что эквивалентно атомам кислорода субстрата в переходном состоянии. [26]
Сообщалось, что IRAP взаимодействует через свой цитоплазматический домен с различными белками, участвующими в везикулярном транспорте, связывании органелл и ремоделировании цитоскелета. Эти белки включают танкиразу-1 , танкиразу-2 и p115, которые регулируют транспорт везикул Гольджи; виментин, промежуточный филамент цитоскелета; и белок ремоделирования актина FHOS. Кроме того, было обнаружено, что IRAP ассоциируется с AS160/Tbc1d4 , активирующим белком Rab GTPase (GAP), специфичным для Rab8 , 10 и 14. Это говорит о том, что IRAP играет роль в привлечении AS160 к эндоцитным мембранам. [29]
Помимо его ассоциации с внутриклеточными транспортными белками, IRAP также взаимодействует с белками, присутствующими в пузырьках хранения Glut4 (GSV), такими как сортилин , LRP1 и Glut4 в адипоцитах . При воспалительных состояниях его роль в транспортировке GSV в адипоцитах регулируется белком TNFa посредством гликозилирования. [29] Недавно было обнаружено его взаимодействие с z-цепью TCR (рецептор Т-клеток) и киназой Lck в Т-лимфоцитах. [16] В дендритных клетках транспортировка везикул, зависящая от IRAP, и транслокация в фагоцитарную чашу регулируются иммунными рецепторами, такими как TLR4 и FcgR. Наконец, было предложено, что IRAP взаимодействует с главными комплексами гистосовместимости класса I (MHC-I) в специализированных эндосомах в ДК. Там он играет роль в перекрестной презентации антигенов. [15]
Терапевтические подходы к регуляции IRAP основаны на разработке пептидомиметиков и ингибиторов малых молекул. Наиболее изученными классами ингибиторов IRAP являются каталитические или аллостерические сайты.
Первые описанные ингибиторы IRAP были разработаны как аналоги ангиотензина IV (AngIV). [30] В 2006 году Аксен и др. опубликовали макроциклизированную версию производного AngIV (соединение 1), которое обеспечивает метаболическую стабильность вместе с высоким сродством к IRAP ( K i = 25,8 нМ). [31] В аналогичном масштабе Лукашук и др. создали соединение AL-11 , которое было способно ингибировать IRAP ( K i = 27,5 нМ) и демонстрировало примерно 200-кратную селективность по сравнению с APN. [32] Дальнейшие структурные модификации ингибиторов на основе AngIV от Андерсона и др. привели к оптимизированному макроциклу HA08 (доступная кристаллическая структура в IRAP, рисунок 2 [28] ) с превосходной активностью IRAP ( K i = 3,3 нМ) и селективностью по сравнению с APN, но плохой метаболической стабильностью. [33]
Соединения на основе бензопирана были идентифицированы в виртуальном скрининге против IRAP в 2008 году и взаимодействуют с катионом цинка каталитического сайта. [33] Все соединения показали специфичность к IRAP против других аминопептидаз с наномолярным сродством, в то время как HFI-419 продемонстрировал самую высокую активность (Ki = 0,48 мкМ) и также был протестирован в биопробах in vivo функции памяти. [34]
Хотя большинство аналогов фосфиновых псевдопептидов, раскрытых Коккалой и др. в 2016 году, были неселективными ингибиторами ERAP, DG026 продемонстрировал наномолярное сродство к IRAP (IC 50 = 32 нМ) с улучшенной селективностью. [35]
Новое семейство соединений диаминобензойной кислоты (DABA), нацеленных на цинк, было рационально разработано с использованием природных и неприродных аминокислотных остатков, с микромолярной активностью в отношении IRAP (соединение 6, IC 50 = 2,1 мкМ) и умеренной селективностью по отношению к ERAP1 и ERAP2. [35] [36]
В 2014 году Ванга и др. признали способность арилсульфонамидов ингибировать IRAP после скрининга библиотеки из 10 500 соединений, подобных препаратам. После дальнейшей оптимизации было разработано соединение 7, демонстрирующее микромолярное сродство к IRAP (IC 50 = 0,8 мкМ). [37]
Были описаны селективные низконаномолярные ингибиторы IRAP на основе α-гидрокси-β-аминоструктуры препарата Убенимекс (Бестатин), демонстрирующие превосходную селективность и сильную клеточную активность при блокировании перекрестной презентации. [38]
В ходе скрининга в 2016 году было выявлено, что спиро-оксиндол дигидрохиназолиновое соединение является одним из наиболее мощных соединений, воздействующих на IRAP. Этот тип соединений демонстрирует высокую специфичность для IRAP против APN (соединение 8 IC 50 = 5,8 мкМ), и согласно исследованиям стыковки, ингибитор действует в связывающем кармане, близком к петле GAMEN, не взаимодействуя с атомом zing, что приводит к неконкурентному ингибированию, подтвержденному позднее кинетическими исследованиями. [39]