Генотипирование SNP — это измерение генетических вариаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) между представителями вида. Это форма генотипирования , которая является измерением более общей генетической изменчивости. SNP — один из наиболее распространенных типов генетической изменчивости. SNP — это мутация одной пары оснований в определенном локусе , обычно состоящая из двух аллелей (где редкая частота аллеля > 1%). Установлено, что SNP участвуют в этиологии многих заболеваний человека и становятся предметом особого интереса в фармакогенетике . Поскольку SNP сохраняются в ходе эволюции, их предложили использовать в качестве маркеров в количественном анализе локусов признаков ( QTL ) и в ассоциативных исследованиях вместо микросателлитов . Использование SNP расширяется в проекте HapMap , целью которого является предоставление минимального набора SNP, необходимых для генотипирования генома человека. SNP также могут предоставить генетический отпечаток для использования в тестировании идентичности. [1] Рост интереса к однонуклеотидным полиморфизмам (SNP) нашел свое отражение в бурном развитии разнообразных методов генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).
Было разработано несколько приложений, которые исследуют SNP путем гибридизации комплементарных ДНК-зондов с сайтом SNP. Проблема этого подхода заключается в снижении перекрестной гибридизации между аллель-специфичными зондами. Эта проблема обычно преодолевается путем манипулирования условиями строгости гибридизации. [1]
Генотипирование с динамической аллель-специфической гибридизацией (DASH) использует разницу в температуре плавления ДНК, которая возникает из-за нестабильности несовпадающих пар оснований. Процесс может быть в значительной степени автоматизирован и включает в себя несколько простых принципов. [ необходима цитата ]
На первом этапе геномный сегмент амплифицируется и прикрепляется к шарику посредством реакции ПЦР с биотинилированным праймером. На втором этапе амплифицированный продукт прикрепляется к колонке со стрептавидином и промывается NaOH для удаления небиотинилированной цепи. Затем добавляется аллель-специфический олигонуклеотид в присутствии молекулы, которая флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК. Затем интенсивность измеряется по мере повышения температуры до тех пор, пока не будет определена температура плавления (Tm) . SNP приведет к более низкой, чем ожидалось, Tm. [2]
Поскольку генотипирование DASH измеряет количественное изменение Tm, оно способно измерять все типы мутаций, а не только SNP. Другие преимущества DASH включают его способность работать с зондами без меток и его простую конструкцию и условия производительности. [ необходима цитата ]
Обнаружение SNP с помощью молекулярных маяков использует специально разработанный одноцепочечный олигонуклеотидный зонд. Олигонуклеотид разработан таким образом, что на каждом конце имеются комплементарные области, а последовательность зонда расположена между ними. Такая конструкция позволяет зонду принимать структуру шпильки или стебля-петли в его естественном изолированном состоянии. К одному концу зонда прикреплен флуорофор, а к другому концу — гаситель флуоресценции. Из-за структуры стебля-петли зонда флуорофор находится близко к гасителю, тем самым предотвращая испускание молекулой какой-либо флуоресценции. Молекула также разработана таким образом, что только последовательность зонда комплементарна геномной ДНК, которая будет использоваться в анализе (Abravaya et al. 2003).
Если зондовая последовательность молекулярного маяка сталкивается с целевой геномной ДНК во время анализа, она отжигается и гибридизуется. Из-за длины зондовой последовательности сегмент шпильки зонда будет денатурирован в пользу формирования более длинного, более стабильного гибрида зонд-мишень. Это конформационное изменение позволяет флуорофору и гасителю освободиться от их тесной близости из-за ассоциации шпильки, что позволяет молекуле флуоресцировать.
С другой стороны, если последовательность зонда встречает целевую последовательность, содержащую всего лишь один некомплементарный нуклеотид, молекулярный маяк предпочтительно останется в своем естественном состоянии шпильки, и флуоресценция наблюдаться не будет, поскольку флуорофор останется погашенным.
Уникальная конструкция этих молекулярных маяков позволяет проводить простой диагностический анализ для идентификации SNP в заданном месте. Если молекулярный маяк разработан для сопоставления с аллелем дикого типа, а другой — для сопоставления с мутантом аллеля, то оба могут использоваться для идентификации генотипа индивидуума. Если во время анализа обнаруживается только длина волны флуорофора первого зонда, то индивидуум гомозиготен по отношению к дикому типу. Если обнаруживается только длина волны второго зонда, то индивидуум гомозиготен по отношению к мутантному аллелю. Наконец, если обнаруживаются обе длины волн, то оба молекулярных маяка должны гибридизироваться со своими комплементами, и, таким образом, индивидуум должен содержать оба аллеля и быть гетерозиготным.
В массивах олигонуклеотидов SNP высокой плотности сотни тысяч зондов располагаются на небольшом чипе, что позволяет одновременно опрашивать множество SNP. [1] Поскольку аллели SNP отличаются только одним нуклеотидом и поскольку трудно достичь оптимальных условий гибридизации для всех зондов на массиве, целевая ДНК имеет потенциал гибридизации с несовпадающими зондами. Это в некоторой степени решается путем использования нескольких избыточных зондов для опроса каждого SNP. Зонды разработаны так, чтобы иметь сайт SNP в нескольких разных местах, а также содержать несовпадения с аллелем SNP. Сравнивая дифференциальное количество гибридизации целевой ДНК с каждым из этих избыточных зондов, можно определить конкретные гомозиготные и гетерозиготные аллели. [1] Хотя микромассивы олигонуклеотидов имеют сравнительно более низкую специфичность и чувствительность, масштаб SNP, которые могут быть опрошены, является основным преимуществом. Генный чип Affymetrix Human SNP 5.0 выполняет полногеномный анализ, позволяющий генотипировать более 500 000 человеческих SNP (Affymetrix 2007).
Для создания высокоточных методов генотипирования SNP был использован широкий спектр ферментов, включая ДНК-лигазу , ДНК-полимеразу и нуклеазы .
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) считается самым простым и ранним методом обнаружения SNP. SNP-RFLP использует множество различных рестрикционных эндонуклеаз и их высокое сродство к уникальным и специфическим сайтам рестрикции. Выполняя переваривание геномного образца и определяя длину фрагментов с помощью гелевого анализа, можно установить, разрезают ли ферменты ожидаемые сайты рестрикции. Неспособность разрезать геномный образец приводит к идентифицируемо большему, чем ожидалось, фрагменту, что подразумевает наличие мутации в точке сайта рестрикции, которая делает его защищенным от активности нуклеазы.
Сочетание таких факторов, как высокая сложность большинства эукариотических геномов, потребность в специфических эндонуклеазах, тот факт, что точную мутацию невозможно определить в одном эксперименте, и медленный характер гелевых анализов, делают RFLP неподходящим выбором для высокопроизводительного анализа.
Система тетрапраймерной амплификации рефрактерных мутаций ПЦР, или ARMS-ПЦР, использует две пары праймеров для амплификации двух аллелей в одной реакции ПЦР. Праймеры разработаны таким образом, что две пары праймеров перекрываются в месте SNP, но каждый идеально соответствует только одному из возможных SNP. Основой изобретения является то, что неожиданно олигонуклеотиды с несовпадающим 3'-остатком не будут функционировать как праймеры в ПЦР при соответствующих условиях. [3] В результате, если заданный аллель присутствует в реакции ПЦР, пара праймеров, специфичная для этого аллеля, будет производить продукт, но не для альтернативного аллеля с другим SNP. Две пары праймеров также разработаны таким образом, что их продукты ПЦР имеют существенно разную длину, что позволяет легко различить полосы с помощью гель-электрофореза или анализа температуры плавления. [4] [5] При изучении результатов, если геномный образец является гомозиготным, то полученные продукты ПЦР будут получены из праймера, соответствующего местоположению SNP, и внешнего праймера противоположной цепи, а также из двух внешних праймеров. Если геномный образец является гетерозиготным, то продукты будут получены из праймера каждого аллеля и их соответствующих внешних праймерных аналогов, а также из внешних праймеров.
Альтернативная стратегия заключается в запуске нескольких реакций qPCR с различными наборами праймеров, которые нацелены на каждый аллель отдельно. Хорошо спроектированные праймеры будут амплифицировать свой целевой SNP на гораздо более раннем цикле, чем другие SNP. Это позволяет различать более двух аллелей, хотя для каждого SNP требуется отдельная реакция qPCR. Для достижения достаточно высокой специфичности последовательность праймера может потребовать размещения искусственного несоответствия вблизи ее 3'-конца, что является подходом, обычно известным как Taq-MAMA. [6]
Flap endonuclease (FEN) — это эндонуклеаза, которая катализирует структурно-специфическое расщепление. Это расщепление очень чувствительно к несовпадениям и может быть использовано для исследования SNP с высокой степенью специфичности [7]
В базовом анализе Invader FEN, называемый расщеплением, объединяется с двумя специфическими олигонуклеотидными зондами, которые вместе с целевой ДНК могут образовывать трехкомпонентную структуру, распознаваемую расщеплением. [7] Первый зонд, называемый олигонуклеотидом Invader, комплементарен 3'-концу целевой ДНК. Последнее основание олигонуклеотида Invader является несовпадающим основанием, которое перекрывает нуклеотид SNP в целевой ДНК. Второй зонд является аллель-специфическим зондом, который комплементарен 5'-концу целевой ДНК, но также простирается за пределы 3'-стороны нуклеотида SNP. Аллель-специфический зонд будет содержать основание, комплементарное нуклеотиду SNP. Если целевая ДНК содержит желаемый аллель, то Invader и аллель-специфические зонды будут связываться с целевой ДНК, образуя трехкомпонентную структуру. Эта структура распознается расщеплением, которое расщепляет и высвобождает 3'-конец аллель-специфического зонда. Если нуклеотид SNP в целевой ДНК не комплементарен аллель-специфическому зонду, правильная трехкомпонентная структура не формируется и расщепления не происходит. Анализ Invader обычно сочетается с системой флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для обнаружения события расщепления. В этой установке молекула гасителя присоединяется к 3'-концу, а флуорофор присоединяется к 5'-концу аллель-специфического зонда. Если происходит расщепление, флуорофор будет отделен от молекулы гасителя, генерируя детектируемый сигнал. [7]
При несовпадении зондов происходит только минимальное расщепление, что делает анализ Invader высокоспецифичным. Однако в его первоначальном формате можно было опрашивать только один аллель SNP на образец реакции, и для генерации обнаруживаемого сигнала в разумные сроки требовалось большое количество целевой ДНК. [7] Несколько разработок расширили исходный анализ Invader . Проводя вторичные реакции расщепления FEN, реакция последовательного усиления инвазивного сигнала (SISAR) позволяет опрашивать оба аллеля SNP в одной реакции. Анализ SISAR Invader также требует меньше целевой ДНК, что повышает чувствительность исходного анализа Invader . [7] Анализ также был адаптирован несколькими способами для использования в формате высокой пропускной способности. На одной платформе аллель-специфичные зонды прикреплены к микросферам. Когда расщепление FEN генерирует обнаруживаемый флуоресцентный сигнал, сигнал измеряется с помощью проточной цитометрии. Чувствительность проточной цитометрии устраняет необходимость в ПЦР-амплификации целевой ДНК (Rao et al. 2003). Эти высокопроизводительные платформы не продвинулись дальше стадии доказательства принципа, и до сих пор система Invader не использовалась ни в одном крупномасштабном проекте генотипирования SNP. [7]
Удлинение праймера — это двухэтапный процесс, который сначала включает гибридизацию зонда с основаниями, расположенными непосредственно выше нуклеотида SNP, за которым следует реакция «мини-секвенирования», в которой ДНК-полимераза удлиняет гибридизированный праймер, добавляя основание, комплементарное нуклеотиду SNP. Это включенное основание обнаруживается и определяет аллель SNP (Goelet et al. 1999; Syvanen 2001). Поскольку удлинение праймера основано на высокоточном ферменте ДНК-полимеразе, метод, как правило, очень надежен. Удлинение праймера способно генотипировать большинство SNP в очень похожих условиях реакции, что делает его также очень гибким. Метод удлинения праймера используется в ряде форматов анализа. Эти форматы используют широкий спектр методов обнаружения, включая масс-спектрометрию MALDI-TOF (см. Sequenom ) и методы, подобные ELISA . [1]
В целом, существует два основных подхода, которые используют включение либо флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (ddNTP), либо флуоресцентно меченых дезоксинуклеотидов (dNTP). С ddNTP зонды гибридизуются с целевой ДНК непосредственно перед нуклеотидом SNP, и один ddNTP, комплементарный аллелю SNP, добавляется к 3'-концу зонда (отсутствующий 3'-гидроксил в дидиоксинуклеотиде предотвращает добавление дополнительных нуклеотидов). Каждый ddNTP маркируется различным флуоресцентным сигналом, что позволяет обнаруживать все четыре аллеля в одной и той же реакции. С dNTP аллель-специфичные зонды имеют 3'-основания, которые комплементарны каждому из исследуемых аллелей SNP. Если целевая ДНК содержит аллель, комплементарный 3'-основанию зонда, целевая ДНК будет полностью гибридизоваться с зондом, позволяя ДНК-полимеразе простираться от 3'-конца зонда. Это обнаруживается путем включения флуоресцентно меченых dNTP в конец зонда. Если целевая ДНК не содержит аллель, комплементарный 3'-основанию зонда, целевая ДНК произведет несоответствие на 3'-конце зонда, и ДНК-полимераза не сможет расшириться с 3'-конца зонда. Преимущество второго подхода заключается в том, что несколько меченых dNTP могут быть включены в растущую цепь, что позволяет усилить сигнал. Однако ДНК-полимераза в некоторых редких случаях может расширяться с несоответствующих 3'-зондов, давая ложноположительный результат. [1]
Другой подход используется в методе генотипирования SNP iPLEX компании Sequenom , который использует масс-спектрометр MassARRAY. Зонды расширения разработаны таким образом, что 40 различных анализов SNP могут быть амплифицированы и проанализированы в коктейле ПЦР. Реакция расширения использует ddNTP, как указано выше, но обнаружение аллеля SNP зависит от фактической массы продукта расширения, а не от флуоресцентной молекулы. Этот метод предназначен для низкой и средневысокой пропускной способности и не предназначен для сканирования всего генома.
Гибкость и специфичность удлинения праймера делают его пригодным для высокопроизводительного анализа. Зонды удлинения праймера могут быть выстроены на слайдах, что позволяет генотипировать множество SNP одновременно. Широко известная как удлинение праймера (APEX), эта технология имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, основанными на дифференциальной гибридизации зондов. Для сравнения, методы APEX обладают большей дискриминирующей способностью, чем методы, использующие эту дифференциальную гибридизацию, поскольку часто невозможно получить оптимальные условия гибридизации для тысяч зондов на ДНК-микрочипах (обычно эта проблема решается за счет наличия высоко избыточных зондов). Однако та же плотность зондов не может быть достигнута в методах APEX, что приводит к более низкому выходу за один запуск. [1]
Анализ Infinium компании Illumina Incorporated является примером полногеномного генотипирования, основанного на методе удлинения праймера. В анализе Infinium можно генотипировать более 100 000 SNP. Анализ использует нуклеотиды, меченные гаптеном, в реакции удлинения праймера. Гаптеновая метка распознается антителами, которые, в свою очередь, связываются с обнаруживаемым сигналом (Gunderson et al. 2006).
APEX-2 — это метод генотипирования с использованием массива праймеров, который позволяет параллельно идентифицировать сотни SNP или мутаций с использованием эффективной гомогенной мультиплексной ПЦР (до 640 плексов) и четырехцветного одноосновного расширения на микроматрице. Мультиплексная ПЦР требует двух олигонуклеотидов на SNP/мутацию, генерирующих ампликоны, которые содержат тестируемую пару оснований. Те же олигонуклеотиды используются на следующем этапе в качестве иммобилизованных одноосновных праймеров расширения на микроматрице (Krjutskov et al. 2008).
5'-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq используется в анализе TaqMan для генотипирования SNP. Анализ TaqMan выполняется одновременно с реакцией ПЦР, и результаты можно считывать в режиме реального времени по мере протекания реакции ПЦР (McGuigan & Ralston 2002). Для анализа требуются прямые и обратные праймеры ПЦР, которые будут амплифицировать область, включающую полиморфный сайт SNP. Дискриминация аллелей достигается с помощью FRET в сочетании с одним или двумя аллель-специфическими зондами, которые гибридизуются с полиморфным сайтом SNP. Зонды будут иметь флуорофор, связанный с их 5'-концом, и молекулу гасителя, связанную с их 3'-концом. Пока зонд нетронут, гаситель будет оставаться в непосредственной близости от флуорофора, устраняя сигнал флуорофора. На этапе амплификации ПЦР, если аллель-специфический зонд идеально комплементарен аллелю SNP, он свяжется с целевой цепью ДНК, а затем будет деградировать под действием 5'-нуклеазной активности полимеразы Taq, поскольку она удлиняет ДНК из праймеров ПЦР. Деградация зонда приводит к отделению флуорофора от молекулы гасителя, что генерирует детектируемый сигнал. Если аллель-специфический зонд не идеально комплементарен, он будет иметь более низкую температуру плавления и не будет связываться так эффективно. Это не позволит нуклеазе воздействовать на зонд (McGuigan & Ralston 2002).
Поскольку анализ TaqMan основан на ПЦР, он относительно прост в реализации. Анализ TaqMan можно мультиплексировать, объединяя обнаружение до семи SNP в одной реакции. Однако, поскольку для каждого SNP требуется отдельный зонд, анализ TaqMan ограничен тем, насколько близко могут быть расположены SNP. Масштаб анализа можно значительно увеличить, выполняя множество одновременных реакций в микротитровальных планшетах. Как правило, TaqMan ограничен приложениями, которые включают исследование небольшого количества SNP, поскольку оптимальные зонды и условия реакции должны быть разработаны для каждого SNP (Syvanen 2001).
ДНК-лигаза катализирует лигирование 3'-конца фрагмента ДНК с 5'-концом непосредственно соседнего фрагмента ДНК. Этот механизм можно использовать для исследования SNP путем гибридизации двух зондов непосредственно над полиморфным сайтом SNP, при этом лигирование может происходить, если зонды идентичны целевой ДНК. В анализе олигонуклеотидной лигазы разрабатываются два зонда: аллель-специфичный зонд, который гибридизуется с целевой ДНК так, что его 3'-основание располагается непосредственно над нуклеотидом SNP, и второй зонд, который гибридизуется с матрицей выше по течению (ниже по течению в комплементарной цепи) полиморфного сайта SNP, предоставляя 5'-конец для реакции лигирования. Если аллель-специфичный зонд соответствует целевой ДНК, он полностью гибридизуется с целевой ДНК, и может произойти лигирование. Лигирование обычно не происходит в присутствии несовпадающего 3'-основания. Лигированные или нелигированные продукты могут быть обнаружены с помощью гель-электрофореза, масс-спектрометрии MALDI-TOF или капиллярного электрофореза для крупномасштабных приложений. [1] При наличии соответствующих последовательностей и меток на олигонуклеотидах высокопроизводительные данные о последовательностях могут быть получены из лигированных продуктов и определенных генотипов (Curry et al., 2012). Использование большого количества индексов образцов позволяет получать высокопроизводительные данные о последовательностях сотен SNP в тысячах образцов за небольшую часть высокопроизводительного цикла секвенирования. Это массивное генотипирование с помощью технологии секвенирования (MGST). [ необходима цитата ]
Характерные свойства ДНК, такие как температура плавления и одноцепочечная конформация, использовались в нескольких приложениях для различения аллелей SNP. Эти методы очень часто достигают высокой специфичности, но требуют высокооптимизированных условий для получения наилучших возможных результатов.
Одноцепочечная ДНК (ssDNA) сворачивается в третичную структуру. Конформация зависит от последовательности, и большинство мутаций одной пары оснований изменят форму структуры. При нанесении на гель третичная форма будет определять подвижность ssDNA, обеспечивая механизм для дифференциации аллелей SNP. Этот метод сначала включает ПЦР-амплификацию целевой ДНК. Двухцепочечные продукты ПЦР денатурируют с использованием тепла и формальдегида для получения ssDNA. ssDNA наносят на неденатурирующий электрофорезный гель и позволяют свернуть в третичную структуру. Различия в последовательности ДНК изменят третичную конформацию и будут обнаружены как разница в подвижности нити ssDNA (Costabile et al. 2006). Этот метод широко используется, поскольку он технически прост, относительно недорог и использует общедоступное оборудование. Однако по сравнению с другими методами генотипирования SNP чувствительность этого анализа ниже. Было обнаружено, что конформация одноцепочечной ДНК сильно зависит от температуры, и обычно неясно, какая температура является идеальной. Очень часто анализ будет проводиться с использованием нескольких различных температур. Также существует ограничение на длину фрагмента, поскольку чувствительность падает при использовании последовательностей длиннее 400 п.н. (Costabile et al. 2006).
Метод электрофореза в градиенте температуры (TGGE) или капиллярного электрофореза в градиенте температуры (TGCE) основан на принципе, что частично денатурированная ДНК более ограничена и движется медленнее в пористом материале, таком как гель. Это свойство позволяет разделять ДНК по температуре плавления. Чтобы адаптировать эти методы для обнаружения SNP, используются два фрагмента: целевая ДНК, которая содержит исследуемый полиморфный сайт SNP, и аллель-специфическая последовательность ДНК, называемая нормальным фрагментом ДНК. Нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциального полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируются, а затем повторно отжигаются. Если целевая ДНК имеет тот же аллель, что и нормальный фрагмент, будут образовываться гомодуплексы, которые будут иметь ту же температуру плавления. При запуске на геле с градиентом температуры появится только одна полоса. Если целевая ДНК имеет отчетливый аллель, после этапа повторного отжига будут образовываться четыре продукта; гомодуплексы, состоящие из целевой ДНК, гомодуплексы, состоящие из нормальной ДНК и два гетеродуплекса каждой цепи целевой ДНК, гибридизированные с нормальной цепью ДНК. Эти четыре продукта будут иметь различные температуры плавления и будут выглядеть как четыре полосы в денатурирующем геле. [1]
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC) использует обращенно-фазовую ВЭЖХ для исследования SNP. Ключом к DHPLC является твердая фаза, которая имеет различное сродство к одно- и двухцепочечной ДНК. В DHPLC фрагменты ДНК денатурируют путем нагревания, а затем подвергают повторному отжигу. Температура плавления повторно отожженных фрагментов ДНК определяет продолжительность времени, в течение которого они удерживаются в колонке. [8] С помощью ПЦР генерируются два фрагмента: целевая ДНК, содержащая полиморфный сайт SNP, и аллель-специфическая последовательность ДНК, называемая нормальным фрагментом ДНК. Этот нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциального полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем подвергают постепенному повторному отжигу. Повторно отожженные продукты добавляются в колонку DHPLC. Если аллель SNP в целевой ДНК совпадает с нормальным фрагментом ДНК, на этапе повторного отжига будут образовываться только идентичные гомодуплексы. Если целевая ДНК содержит другой аллель SNP, чем нормальный фрагмент ДНК, то в дополнение к гомодуплексам будут образовываться гетеродуплексы целевой ДНК и нормальной ДНК, содержащие несовпадающий полиморфный сайт. Несовпадающие гетеродуплексы будут иметь другую температуру плавления, чем гомодуплексы, и не будут удерживаться в колонке так долго. Это создает хроматографическую картину, которая отличается от картины, которая была бы создана, если бы целевой фрагмент ДНК и нормальные фрагменты ДНК были идентичны. Элюированная ДНК обнаруживается с помощью поглощения УФ-излучения. [8]
DHPLC легко автоматизировать, поскольку не требуется маркировка или очистка фрагментов ДНК. Метод также относительно быстрый и имеет высокую специфичность. Одним из основных недостатков DHPLC является то, что температура колонки должна быть оптимизирована для каждой цели, чтобы достичь правильной степени денатурации. [1]
Анализ плавления высокого разрешения — самый простой для понимания метод на основе ПЦР. По сути, здесь применяются те же термодинамические свойства, которые позволили работать гелевой технике, причем в режиме реального времени. Флуориметр отслеживает пост-ПЦР-денатурацию всего ампликона dsDNA. Вы создаете праймеры, специфичные для участка, который вы хотите амплифицировать. Вы «окрашиваете» ампликон двухцепочечным специфическим красителем, включенным в смесь ПЦР. Специфический для ds краситель интегрируется в продукт ПЦР. По сути, весь ампликон становится зондом. Это открывает новые возможности для открытий. Либо вы размещаете праймеры очень близко к любой стороне рассматриваемого SNP (генотипирование малых ампликонов, Liew, 2004), либо амплифицируете большую область (длиной 100–400 п.н.) для целей сканирования. Для простого генотипирования SNP проще просто сделать ампликон маленьким, чтобы свести к минимуму вероятность того, что вы перепутаете один SNP с другим. Температура плавления (Tm) всего ампликона определяется, и большинство гомозигот достаточно различаются (в лучших приборах) по Tm для генотипирования. Гетерозиготы еще легче дифференцировать, поскольку у них образуются гетеродуплексы (см. объяснения на основе геля), которые расширяют переход плавления и обычно дают два различимых пика. Плавление ампликона с использованием флуоресцентно-меченого праймера было описано (Gundry et al., 2003), но оно менее практично, чем использование ds-специфичных красителей из-за стоимости флуорогенного праймера.
Сканирование более крупных ампликонов основано на тех же принципах, что описаны выше. Однако температура плавления и общая форма кривой плавления становятся информативными. Для ампликонов >c.150bp часто наблюдается >2 пиков плавления, каждый из которых может варьироваться в зависимости от состава шаблона ДНК. Многочисленным исследователям удалось успешно устранить большую часть их секвенирования с помощью сканирования на основе плавления, что позволило провести точное генотипирование на основе локусов большого количества людей. [9] Многие исследователи обнаружили, что сканирование мутаций с использованием плавления высокого разрешения является жизнеспособным и практичным способом изучения целых генов.
Связывающие белки несовпадений ДНК могут различать несовпадения отдельных нуклеотидов и, таким образом, облегчать дифференциальный анализ SNP. Например, белок MutS из Thermus aquaticus связывает различные несовпадения отдельных нуклеотидов с разным сродством и может использоваться в капиллярном электрофорезе для дифференциации всех шести наборов несовпадений (Drabovich & Krylov 2006).
SNPlex — это запатентованная платформа генотипирования, продаваемая компанией Applied Biosystems .
Нуклеаза Surveyor — это фермент эндонуклеазы несовпадения оснований, который распознает все замены оснований и небольшие вставки/делеции (индели) и расщепляет 3'-сторону несовпадающих участков в обеих цепях ДНК.
Технологии секвенирования следующего поколения, такие как пиросеквенирование последовательности менее 250 оснований в считывании, что ограничивает их способность секвенировать целые геномы. Однако их способность генерировать результаты в режиме реального времени и их потенциал для массового масштабирования делают их жизнеспособным вариантом для секвенирования небольших регионов для выполнения генотипирования SNP. По сравнению с другими методами генотипирования SNP, секвенирование, в частности, подходит для идентификации нескольких SNP в небольшом регионе, таком как высокополиморфный регион главного комплекса гистосовместимости генома. [1]