Нуклеотидная эксцизионная репарация — это механизм репарации ДНК . [2] Повреждение ДНК происходит постоянно из-за химических веществ (например, интеркалирующих агентов ), радиации и других мутагенов . Существует три пути эксцизионной репарации для восстановления одноцепочечных повреждений ДНК: нуклеотидная эксцизионная репарация (NER), базовая эксцизионная репарация (BER) и репарация несоответствия ДНК (MMR). Хотя путь BER может распознавать определенные необъемные повреждения в ДНК, он может исправлять только поврежденные основания, которые удаляются определенными гликозилазами . Аналогично, путь MMR нацелен только на несоответствующие пары оснований Уотсона-Крика .
Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) является особенно важным механизмом эксцизии, который удаляет повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым светом (УФ). Повреждение ДНК УФ приводит к образованию объемных аддуктов ДНК — эти аддукты в основном представляют собой димеры тимина и 6,4-фотопродукты. Распознавание повреждения приводит к удалению короткого одноцепочечного сегмента ДНК, содержащего повреждение. Остается неповрежденная одноцепочечная ДНК, и ДНК-полимераза использует ее в качестве матрицы для синтеза короткой комплементарной последовательности . Окончательное лигирование для завершения NER и формирования двухцепочечной ДНК выполняется ДНК-лигазой . NER можно разделить на два подпути: глобальный геномный NER (GG-NER или GGR) и связанный с транскрипцией NER (TC-NER или TCR). Два подпути различаются по тому, как они распознают повреждения ДНК, но они используют один и тот же процесс разрезания, восстановления и лигирования повреждения.
О важности NER свидетельствуют тяжелые заболевания человека, возникающие в результате врожденных генетических мутаций белков NER. Пигментная ксеродерма и синдром Коккейна — два примера заболеваний, связанных с NER.
Нуклеотидная эксцизионная репарация более сложна у эукариот , чем у прокариот , которые экспрессируют ферменты, такие как фотолиаза . У людей и других плацентарных животных в NER участвуют 9 основных белков. Дефицит определенных белков приводит к заболеванию; названия белков связаны с заболеванием. XPA , XPB , XPC , XPD, XPE , XPF и XPG происходят от пигментной ксеродермы , а CSA и CSB представляют собой белки, связанные с синдромом Коккейна. Кроме того, белки ERCC1 , RPA , RAD23A , RAD23B и другие также участвуют в нуклеотидной эксцизионной репарации. Более полный список белков, участвующих в NER, приведен ниже.
Эукариотическую эксцизионную репарацию нуклеотидов можно разделить на два подпутя: глобальный геномный NER (GG-NER) и связанный с транскрипцией NER (TC-NER). Три различных набора белков участвуют в распознавании повреждений ДНК для каждого подпутя. После распознавания повреждений три подпутя сходятся для этапов двойного разреза, репарации и лигирования.
Глобальный геномный NER восстанавливает повреждения как в транскрибированных, так и в нетранскрибированных цепях ДНК в активных и неактивных генах по всему геному. Этот процесс не зависит от транскрипции. Этот путь использует несколько белков «чувствительных к повреждениям», включая связывание ДНК-повреждений (DDB) и комплексы XPC-Rad23B, которые постоянно сканируют геном и распознают искажения спирали: комплекс XPC -Rad23B отвечает за распознавание искажений, в то время как DDB1 и DDB2 ( XPE ) также могут распознавать некоторые типы повреждений, вызванных УФ-светом. Кроме того, XPA выполняет функцию распознавания повреждений, которая пока плохо определена. После идентификации поврежденного участка последующие белки восстановления затем привлекаются к поврежденной ДНК, чтобы проверить наличие повреждения ДНК, вырезать поврежденную ДНК, окружающую повреждение, а затем заполнить заплатку восстановления.
Мутации в механизме GG-NER являются причиной множества генетических нарушений, включая:
В любой момент времени большая часть генома в организме не подвергается транскрипции; существует разница в эффективности NER между транскрипционно молчащими и транскрипционно активными областями генома. Для многих типов повреждений NER восстанавливает транскрибированные цепи транскрипционно активных генов быстрее, чем нетранскрибированные цепи и транскрипционно молчащую ДНК.
TC-NER и GG-NER отличаются только начальными этапами распознавания повреждений ДНК. Принципиальное различие между TC-NER и GG-NER заключается в том, что TC-NER не требует белков XPC или DDB для распознавания искажений в клетках млекопитающих. Вместо этого TC-NER инициируется, когда РНК-полимераза останавливается на повреждении в ДНК: заблокированная РНК-полимераза служит сигналом распознавания повреждений, что заменяет необходимость в свойствах распознавания искажений комплексов XPC-RAD23B и DDB. Белки CS (CSA и CSB) связывают некоторые типы повреждений ДНК вместо XPC-Rad23B.
Возможны и другие механизмы ремонта, но они менее точны и эффективны.
TC-NER инициируется, когда РНК-полимераза останавливается на повреждении в ДНК, после чего белковые комплексы помогают переместить полимеразу назад. Мутации в механизме TC-NER ответственны за множество генетических нарушений, включая:
Фактор транскрипции II H (TFIIH) является ключевым ферментом, участвующим в двойном вырезании. TFIIH и XPG сначала привлекаются к месту повреждения ДНК (XPG стабилизирует TFIIH). Субъединицы TFIIH XPD и XPB действуют как 5'-3' и 3'-5' геликаза соответственно — они помогают раскручивать ДНК и создавать соединение между двухцепочечной и одноцепочечной ДНК вокруг транскрипционного пузыря . Помимо стабилизации TFIIH, XPG также обладает эндонуклеазной активностью; он разрезает повреждение ДНК на 3'- стороне, в то время как гетеродимерный белок XPF – ERCC1 разрезает на 5'-стороне. Двойное разрезание приводит к удалению одноцепочечной ДНК с одноцепочечным разрывом в 25~30 нуклеотидов. Небольшие, вырезанные, содержащие повреждения ДНК (sedDNA) олигонуклеотиды первоначально высвобождаются из дуплекса в комплексе с TFIIH, но затем диссоциируют АТФ-зависимым образом и связываются с репликационным белком A (RPA). Ингибирование синтеза ДНК, заполняющей пробелы, и лигирования приводит к накоплению связанных с RPA sedDNA в клетке.
Репликационный белок A (RPA) и XPA — последние два белка, связанные с основным комплексом репарации NER. Эти два белка присутствуют до связывания TFIIH, поскольку они участвуют в проверке повреждения ДНК. Они также могут защищать одноцепочечную ДНК. После проверки выполняется разрез с 5'-стороны, и репарация ДНК начинается до разреза с 3'-стороны. Это помогает уменьшить количество открытой одноцепочечной ДНК во время процесса репарации.
Фактор репликации C ( RFC ) загружает ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) на цепь ДНК. Это позволяет ДНК-полимеразам, участвующим в репарации (δ, ε и/или κ), копировать неповрежденную цепь посредством транслокации. ДНК-лигаза I и эндонуклеаза лоскута 1 или комплекс лигазы-III-XRCC1 запечатывают надрезы, завершая NER.
Процесс репарации нуклеотидов эксцизией контролируется в Escherichia coli комплексом ферментов эндонуклеазы UvrABC , который состоит из четырех белков Uvr: UvrA, UvrB, UvrC и ДНК-хеликазы II (иногда также известной как UvrD в этом комплексе). Сначала комплекс UvrA-UvrB сканирует ДНК, при этом субъединица UvrA распознает искажения в спирали, вызванные, например, пиримидиновыми димерами . Когда комплекс распознает такое искажение, субъединица UvrA уходит, а белок UvrC входит и связывается с мономером UvrB и, таким образом, образует новый димер UvrBC . UvrB расщепляет фосфодиэфирную связь на 4 нуклеотида ниже повреждения ДНК, а UvrC расщепляет фосфодиэфирную связь на 8 нуклеотидов выше повреждения ДНК и создает вырезанный сегмент из 12 нуклеотидов. Затем вступает ДНК-хеликаза II (иногда называемая UvrD) и удаляет вырезанный сегмент, активно разрывая водородные связи между комплементарными основаниями. Образовавшийся пробел затем заполняется с помощью ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Основной процесс вырезания очень похож в высших клетках, но эти клетки обычно включают гораздо больше белков — E.coli является простым примером. [5]
TC-NER также существует в бактериях и опосредован белком TRCF (Mfd) . TRCF — это АТФаза SF2 , которая использует гидролиз АТФ для транслокации на dsDNA выше транскрипционного пузыря и прямой транслокации РНК-полимеразы, тем самым инициируя диссоциацию тройного комплекса удлинения РНК-полимеразы. TRCF также рекрутирует аппарат эксцизионной репарации нуклеотидов Uvr(A)BC путем прямого физического взаимодействия с субъединицей UvrA.
Хотя исторические исследования показали противоречивые результаты, генетическая вариация или мутация в генах эксцизионной репарации нуклеотидов может влиять на риск рака , влияя на эффективность репарации. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и несинонимичные кодирующие SNP (nsSNP) присутствуют в очень низких уровнях (>1%) в человеческой популяции. [7] Если такие мутации находятся в генах NER или регуляторных последовательностях, они могут отрицательно влиять на способность репарации ДНК, что приводит к увеличению вероятности развития рака. Хотя функциональное воздействие всех полиморфизмов не было охарактеризовано, некоторые полиморфизмы в генах репарации ДНК или их регуляторных последовательностях действительно вызывают фенотипические изменения и участвуют в развитии рака. [8] Исследование случаев рака легких обнаружило скромную связь между специфическими полиморфизмами SNP NER и риском рака легких. [9] Результаты показывают, что некоторые унаследованные полиморфные вариации в генах NER могут приводить к предрасположенности к раку легких и потенциально другим онкологическим состояниям.
Два важных гена в пути NER, для которых полиморфизм показал функциональное и фенотипическое воздействие, — это гены XPD и XPC . [10] XPD, также известный как ERCC2, служит для открытия ДНК вокруг места повреждения во время NER, в дополнение к другим транскрипционным активностям. Исследования показали, что полиморфизмы в экзоне 10 (G>A)(Asp312Asn) и экзоне 23 (A>T)(Lys751Gln) связаны с генетической предрасположенностью к нескольким типам рака. [11] [12] Ген XPC отвечает за белок, который распознает ДНК на ранней стадии пути NER. Этот ген может иметь полиморфизмы в интроне 9 и однонуклеотидные полиморфизмы в экзоне 15, которые также коррелируют с риском рака. Исследования показали, что биаллельный поли(AT)-вставочный/делеционный полиморфизм в интроне 9 гена XPC связан с повышенным риском развития рака кожи, молочной железы и простаты, [12] [13] [14], особенно в популяциях Северной Индии.
Изучение наследственного рака, пигментной ксеродермы, помогло идентифицировать несколько генов, которые кодируют белки в пути NER, два из которых — XPC и XPD. XP вызван гомозиготным дефицитом репарации повреждений ДНК ультрафиолетом (GG-NER), что увеличивает риск рака кожи у пациентов в 1000 раз. У гетерозиготных пациентов риск рака спорадический, но может быть предсказан на основе аналитической оценки полиморфизмов в связанных с XP генах репарации ДНК, очищенных от лимфоцитов . [15] В исследовании частоты рецидивов колоректального рака II и III стадии высокого риска полиморфизм XPD (ERCC2) 2251A>C значительно коррелировал с ранним рецидивом после химиотерапевтического лечения. [16] Исследования показали, что эффекты полиморфных генов NER являются аддитивными, с большей частотой вариантов, больший риск рака присутствует. [15] [16] [17]
У людей и мышей мутация зародышевой линии в генах, задействованных в NER, вызывает признаки преждевременного старения. Эти гены и соответствующие им белки включают ERCC1 ( ERCC1 ), ERCC2 (XPD), ERCC3 ( XPB ), ERCC4 (XPF), ERCC5 (XPG), ERCC6 (CSB) и ERCC8 (CSA).
Мутантные мыши ERCC1 с дефицитом репарации ДНК демонстрируют признаки ускоренного старения и имеют ограниченную продолжительность жизни. [18] Ускоренное старение у мутанта затрагивает многочисленные органы.
Мутации в гене ERCC2 (XPD) могут приводить к различным синдромам, либо к пигментной ксеродерме (XP), трихотиодистрофии (TTD) или комбинации XP и TTD (XPTTD), или комбинации XP и синдрома Коккейна (XPCS). [19] TTD и CS оба демонстрируют признаки преждевременного старения. Эти признаки могут включать в себя сенсоневральную глухоту , дегенерацию сетчатки, гипометилирование белого вещества, кальцификацию центральной нервной системы, снижение роста и кахексию (потерю подкожной жировой ткани). [19] [20] Фибробласты XPCS и TTD от мутантного человека и мыши ERCC2 (XPD) демонстрируют доказательства дефектного восстановления окислительных повреждений ДНК, которые могут лежать в основе симптомов сегментарного прогероида (преждевременного старения) [21] (см. Теория повреждения ДНК при старении ).
Мутации в гене ERCC3 (XPB) могут привести у людей к пигментной ксеродерме (XP) или XP в сочетании с синдромом Коккейна (XPCS). [22]
Дефицит ERCC4 (XPF) у людей приводит к различным состояниям, включая ускоренное старение. [23]
У людей мутационные дефекты в гене ERCC5 (XPG) могут вызывать либо предрасположенное к раку состояние пигментной ксеродермы (XP), либо в сочетании с тяжелым нейроразвивающимся расстройством синдромом Коккейна (CS) или младенческим летальным церебро-окуло-фацио-скелетным синдромом. [24] Модель мыши с мутацией ERCC5 (XPG) демонстрирует признаки преждевременного старения, включая кахексию и остеопороз с выраженными дегенеративными фенотипами как в печени, так и в мозге. [24] Эти мыши с мутацией развивают мультисистемный дегенеративный фенотип преждевременного старения, который, по-видимому, усиливает связь между повреждением ДНК и старением . [24] (см. Теория повреждения ДНК при старении ).
Синдром Коккейна (CS) возникает из-за мутаций в зародышевой линии в одном из двух генов ERCC8 (CSA) или ERCC6 (CSB). Мутации ERCC8 (CSA) обычно приводят к более умеренной форме CS, чем мутации ERCC6 (CSB). [25] Мутации в гене CSA составляют около 20% случаев CS. [26] Люди с CSA и CSB характеризуются тяжелым постнатальным ростом и умственной отсталостью, а также ускоренным старением, что приводит к преждевременной смерти в возрасте от 12 до 16 лет. [27]
Как было рассмотрено Горбуновой и др. [28], исследования NER в различных клетках и тканях молодых и старых людей часто показывают снижение емкости NER с увеличением возраста. Это снижение может быть связано с уменьшением конститутивных уровней белков, задействованных в пути NER. [29]