Изоэлектрическое фокусирование ( ИЭФ ), также известное как электрофокусирование , представляет собой метод разделения различных молекул по разнице их изоэлектрической точки (pI). [1] [2] Это тип зонного электрофореза , обычно выполняемый на белках в геле , который использует тот факт, что общий заряд интересующей молекулы является функцией pH ее окружения. [3]
ИЭФ включает добавление раствора амфолита в гели с иммобилизованным градиентом pH (IPG). IPG представляют собой матрицу акриламидного геля, сополимеризованную с градиентом pH, что приводит к полностью стабильным градиентам, за исключением самых щелочных (>12) значений pH. Иммобилизованный градиент pH получается путем непрерывного изменения соотношения иммобилинов . Иммобилин представляет собой слабую кислоту или основание, определяемое его значением pK.
Белок, который находится в области pH ниже своей изоэлектрической точки (pI), будет иметь положительный заряд и, таким образом, будет мигрировать к катоду (отрицательно заряженному электроду). Однако, по мере того, как он мигрирует через градиент увеличивающегося pH, общий заряд белка будет уменьшаться до тех пор, пока белок не достигнет области pH, соответствующей его pI. В этой точке у него нет чистого заряда, и, таким образом, миграция прекращается (поскольку нет электрического притяжения ни к одному из электродов). В результате белки фокусируются в четкие стационарные полосы, причем каждый белок располагается в точке градиента pH, соответствующей его pI. Метод способен обеспечивать чрезвычайно высокое разрешение, при этом белки, отличающиеся одним зарядом, фракционируются в отдельные полосы.
Молекулы, которые должны быть сфокусированы, распределяются по среде, которая имеет градиент pH (обычно создаваемый алифатическими амфолитами ). Электрический ток пропускается через среду, создавая «положительный» анод и «отрицательный» катод . Отрицательно заряженные молекулы мигрируют через градиент pH в среде к «положительному» концу, в то время как положительно заряженные молекулы движутся к «отрицательному» концу. Когда частица движется к полюсу, противоположному ее заряду, она движется через изменяющийся градиент pH, пока не достигнет точки, в которой достигается pH изоэлектрической точки этой молекулы. В этой точке молекула больше не имеет чистого электрического заряда (из-за протонирования или депротонирования связанных функциональных групп) и, как таковая, не будет продвигаться дальше внутри геля. Градиент устанавливается до добавления интересующих частиц путем предварительного подвергания электрофорезу раствора малых молекул, таких как полиамфолиты с различными значениями pI.
Метод применяется особенно часто при изучении белков , которые разделяются на основе их относительного содержания кислотных и основных остатков , значение которых представлено pI. Белки вводятся в иммобилизованный гель градиента pH , состоящий из полиакриламида , крахмала или агарозы , где установлен градиент pH. Гели с большими порами обычно используются в этом процессе для устранения любых эффектов «просеивания» или артефактов в pI, вызванных различными скоростями миграции белков разных размеров. Изоэлектрическое фокусирование может разделять белки, которые отличаются по значению pI всего на 0,01. [4] Изоэлектрическое фокусирование является первым шагом в двумерном гель-электрофорезе , в котором белки сначала разделяются по их значению pI, а затем далее разделяются по молекулярной массе с помощью SDS-PAGE . Изоэлектрическое фокусирование, с другой стороны, является единственным шагом в препаративном нативном PAGE при постоянном pH. [5]
Согласно некоторым мнениям, [6] [7] живые эукариотические клетки выполняют изоэлектрическую фокусировку белков внутри себя, чтобы преодолеть ограничение скорости метаболической реакции за счет диффузии ферментов и их реагентов, а также регулировать скорость определенных биохимических процессов. Концентрируя ферменты определенных метаболических путей в отдельных и небольших областях своего внутреннего пространства, клетка может увеличить скорость определенных биохимических путей на несколько порядков. Изменяя изоэлектрическую точку (pI) молекул фермента, например, фосфорилированием или дефосфорилированием, клетка может переносить молекулы фермента между различными частями своего внутреннего пространства, чтобы включать или выключать определенные биохимические процессы.
Электрофорез на основе микрочипов является многообещающей альтернативой капиллярному электрофорезу , поскольку он может обеспечить быстрый анализ белков, простую интеграцию с другими операциями микрофлюидных устройств, обнаружение по всему каналу, использование нитроцеллюлозных пленок, меньшие размеры образцов и более низкие затраты на производство.
Возросший спрос на более быстрые и простые в использовании инструменты для разделения белков ускорил эволюцию ИЭФ в сторону разделения в растворе. В этом контексте была разработана многосоединительная система ИЭФ для выполнения быстрого и безгелевого разделения ИЭФ. Многосоединительная система ИЭФ использует ряд сосудов с капилляром, проходящим через каждый сосуд. [8] Часть капилляра в каждом сосуде заменена полупроницаемой мембраной. Сосуды содержат буферные растворы с различными значениями pH, так что внутри капилляра эффективно устанавливается градиент pH. Буферный раствор в каждом сосуде имеет электрический контакт с делителем напряжения, подключенным к высоковольтному источнику питания, который устанавливает электрическое поле вдоль капилляра. Когда образец (смесь пептидов или белков) вводится в капилляр, наличие электрического поля и градиента pH разделяет эти молекулы в соответствии с их изоэлектрическими точками. Многоканальная система ИЭФ использовалась для разделения смесей триптических пептидов для двумерной протеомики [9] и белков плазмы крови пациентов с болезнью Альцгеймера для обнаружения биомаркеров. [8]