stringtranslate.com

Гель-электрофорез белков

Белки, разделенные методом SDS-PAGE , окрашивание Кумасси бриллиантовым синим

Электрофорез белков — это метод анализа белков в жидкости или экстракте. Электрофорез может быть выполнен с небольшим объемом образца несколькими альтернативными способами с использованием или без использования поддерживающей среды, а именно агарозы или полиакриламида . Варианты гель-электрофореза включают SDS-PAGE , электрофорез свободного потока , электрофокусировку , изотахофорез , аффинный электрофорез , иммуноэлектрофорез , контрэлектрофорез и капиллярный электрофорез . Каждый вариант имеет множество подтипов с индивидуальными преимуществами и ограничениями. Гель-электрофорез часто выполняется в сочетании с электроблоттингом или иммуноблоттингом для получения дополнительной информации о конкретном белке. [1]

Методы денатурирования геля

SDS-ПААГ

SDS-PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия , описывает набор родственных методов разделения белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией молекулярной массы полипептидной цепи) в денатурированном (развернутом) состоянии. В большинстве белков связывание SDS с полипептидной цепью обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза. [2]

SDS — это сильный детергент, используемый для денатурации нативных белков в развернутые индивидуальные полипептиды . Когда смесь белков нагревается до 100 °C в присутствии SDS, детергент обволакивает полипептидный остов. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержнеобразными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть тем же самым чистым отрицательным зарядом на единицу длины. Электрофоретическая подвижность этих белков будет линейной функцией логарифмов их молекулярных масс. [3]

Нативные гелевые методы

Нативные гели, также известные как неденатурирующие гели, анализируют белки, которые все еще находятся в свернутом состоянии. Таким образом, электрофоретическая подвижность зависит не только от отношения заряда к массе, но и от физической формы и размера белка. [4]

Синий родной СТРАНИЦА

BN-PAGE — это нативная техника PAGE , в которой краситель Кумасси бриллиантовый синий обеспечивает необходимые заряды белковых комплексов для электрофоретического разделения. [5] [6] Недостатком Кумасси является то, что при связывании с белками он может действовать как детергент, вызывая диссоциацию комплексов. Другим недостатком является потенциальное гашение хемолюминесценции ( например , при последующем обнаружении вестерн -блоттинга или анализах активности) или флуоресценции белков с простетическими группами (например, гем или хлорофилл ) или меченых флуоресцентными красителями. [ необходима цитата ]

Очистить родную СТРАНИЦУ

CN-PAGE (обычно называемый Native PAGE) разделяет кислые водорастворимые и мембранные белки в градиентном геле полиакриламида . Он не использует заряженный краситель, поэтому электрофоретическая подвижность белков в CN-PAGE (в отличие от метода сдвига заряда BN-PAGE) связана с собственным зарядом белков. [7] Расстояние миграции зависит от заряда белка, его размера и размера пор геля. Во многих случаях этот метод имеет более низкое разрешение, чем BN-PAGE, но CN-PAGE дает преимущества всякий раз, когда краситель Кумасси будет мешать дальнейшим аналитическим методам, например, он был описан как очень эффективный метод микромасштабного разделения для анализов FRET . [8] Кроме того, поскольку CN-PAGE не требует жестких условий BN-PAGE, он может удерживать надмолекулярные сборки комплексов мембранных белков , которые будут диссоциированы в BN-PAGE. [7]

Препаративный нативный ПААГ

Свернутые белковые комплексы интереса разделяются чисто и предсказуемо без риска денатурации из-за специфических свойств полиакриламидного геля, буферного раствора для электрофореза, электрофоретического оборудования и стандартизированных используемых параметров. Разделенные белки непрерывно элюируются в физиологический элюент и транспортируются в коллектор фракций. В четырех-пяти фракциях PAGE каждая различные металлические кофакторы могут быть идентифицированы и абсолютно количественно определены с помощью ICP-MS высокого разрешения . Связанные структуры изолированных металлопротеинов в этих фракциях могут быть специально определены с помощью спектроскопии ЯМР раствора . [9]

Буферные системы

Предполагаемая миграция белков в системе геля Лэммли A: Накапливающий гель, B: Разделяющий гель, o: Нанесение образца c: разрывы в буфере и электрофоретической матрице

Большинство разделений белков выполняется с использованием «прерывистой» (или DISC) буферной системы, которая значительно повышает четкость полос в геле. Во время электрофореза в прерывистой гелевой системе на ранней стадии электрофореза образуется ионный градиент, который заставляет все белки фокусироваться в одну четкую полосу. Формирование ионного градиента достигается путем выбора значения pH, при котором ионы буфера заряжены лишь умеренно по сравнению с покрытыми SDS белками. Эти условия обеспечивают среду, в которой реакции Кольрауша определяют молярную проводимость . В результате покрытые SDS белки концентрируются в несколько раз в тонкой зоне порядка 19 мкм в течение нескольких минут. На этой стадии все белки мигрируют с одинаковой скоростью миграции посредством изотахофореза . Это происходит в области геля, которая имеет более крупные поры, так что матрица геля не замедляет миграцию во время фокусировки или «укладки». [10] [11] Разделение белков по размеру достигается в нижней, «разрешающей» области геля. Разрешающий гель обычно имеет гораздо меньший размер пор, что приводит к эффекту просеивания, который теперь определяет электрофоретическую подвижность белков. В то же время разделяющая часть геля также имеет значение pH, при котором буферные ионы в среднем несут больший заряд, заставляя их «обгонять» покрытые SDS белки и устранять ионный градиент и, таким образом, эффект стекирования. [ необходима цитата ]

Очень распространенной прерывистой буферной системой является система трис-глицина или « Laemmli », которая складывается при pH 6,8 и распадается при pH ~8,3-9,0. Недостатком этой системы является то, что эти значения pH могут способствовать образованию дисульфидных связей между остатками цистеина в белках, поскольку pKa цистеина колеблется от 8 до 9, а восстанавливающий агент, присутствующий в загрузочном буфере, не мигрирует вместе с белками. Недавние достижения в технологии буферизации смягчают эту проблему, разрешая белки при pH значительно ниже pKa цистеина (например, бис-трис , pH 6,5) и включают восстанавливающие агенты (например, бисульфит натрия), которые перемещаются в гель раньше белков для поддержания восстановительной среды. Дополнительным преимуществом использования буферов с более низкими значениями pH является то, что акриламидный гель более стабилен при более низких значениях pH, поэтому гели можно хранить в течение длительных периодов времени перед использованием. [12] [13]

Градиентный гель-электрофорез белков SDS

При приложении напряжения анионы (и отрицательно заряженные молекулы образца) мигрируют к положительному электроду (аноду) в нижней камере, ведущим ионом является Cl − (высокая подвижность и высокая концентрация); глицинат является замыкающим ионом (низкая подвижность и низкая концентрация). Частицы SDS-белка не мигрируют свободно на границе между Cl − гелевого буфера и Gly − катодного буфера. Фридрих Кольрауш обнаружил, что закон Ома применим также к растворенным электролитам . Из-за падения напряжения между буферами Cl − и Glycine белки сжимаются (укладываются) в микрометровые тонкие слои. [14] Граница движется через градиент пор, и белковый стек постепенно рассеивается из-за увеличения сопротивления трения гелевой матрицы. Укладка и раскладка происходят непрерывно в градиентном геле для каждого белка в другом положении. Для полного разделения белков концентрация полиакриламидного геля должна превышать 16% Т. Двухгелевая система «Лэммли» представляет собой простой градиентный гель. Разрыв pH буферов не имеет значения для качества разделения, и «укладочный гель» с другим pH не нужен. [15]

Визуализация

Самый популярный краситель для белков — кумасси бриллиантовый синий . Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенного в гель, можно удалить, обесцвечивая тем же раствором без красителя. Белки определяются как синие полосы на чистом фоне. [16] [17]

Когда требуется более чувствительный метод, чем окрашивание Кумасси, обычно используется окрашивание серебром. Окрашивание серебром — это чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях, но также может визуализировать нуклеиновые кислоты или полисахариды. [17]

На рынке доступны методы визуализации без использования красителя, такого как Кумасси и серебро. [18] Например, Bio-Rad Laboratories продает «неокрашивающиеся» гели для гель-электрофореза SDS-PAGE. В качестве альтернативы можно использовать обратимые флуоресцентные красители, такие как от Azure Biosystems, такие как AzureRed или Azure TotalStain Q. [17] [18] [19]

Аналогично электрофорезу нуклеиновых кислот в геле, часто используется отслеживающий краситель . Анионные красители с известной электрофоретической подвижностью обычно включаются в буфер образца. Очень распространенным отслеживающим красителем является бромфеноловый синий . Этот краситель окрашивается при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду. Будучи высокомобильной молекулой, она движется впереди большинства белков. [20]

Медицинские приложения

Схематическое изображение геля для электрофореза белков.
Электрофорез сывороточных белков, показывающий парапротеин (пик в гамма-зоне) у пациента с множественной миеломой .

В медицине электрофорез белков — это метод анализа белков , в основном в сыворотке крови . До широкого распространения гель-электрофореза электрофорез белков проводился как электрофорез свободного потока (на бумаге) или как иммуноэлектрофорез. [ необходима цитата ]

Традиционно рассматриваются два класса белков крови : сывороточный альбумин и глобулин . Они, как правило, равны по пропорции, но альбумин как молекула намного меньше и слегка, отрицательно заряжен, что приводит к накоплению альбумина на электрофоретическом геле. Небольшая полоса перед альбумином представляет собой транстиретин (также называемый преальбумином). Некоторые формы лекарств или химических веществ организма могут вызывать свою собственную полосу, но она обычно небольшая. Аномальные полосы (шипы) наблюдаются при моноклональной гаммапатии неопределенного значения и множественной миеломе и полезны при диагностике этих состояний. [ необходима цитата ]

Глобулы классифицируются по их рисунку полос (с указанием их основных представителей): [ необходима ссылка ]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Мичов, Будин (2022). Основы электрофореза: Основы теории и практики . De Gruyter. стр. 490. doi : 10.1515/9783110761641. ISBN 9783110761641. S2CID  247987700.
  2. ^ Стрингер, Р. (2005). «Электрофорез». Энциклопедия аналитической науки (2-е изд.). Королевская университетская больница Ливерпуля. стр. 360. doi :10.1016/B0-12-369397-7/00120-5. ISBN 978-0-12-369397-6.
  3. ^ Мередит, С. К. (1984). «Определение молекулярной массы белков методом гель-проникающей хроматографии в органических растворителях». Журнал биологической химии . 259 (19): 11682–11685. doi : 10.1016/s0021-9258(20)71263-9 . ISSN  0021-9258. PMID  6480578.
  4. ^ Eubel, Holger; Braun, Hans-Peter; Millar, AHarvey (2005). "Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions". Plant Methods . 1 (1): 11. doi : 10.1186/1746-4811-1-11 . ISSN  1746-4811. PMC 1308860. PMID 16287510  . 
  5. ^ Шеггер, Герман; фон Ягов, Гебхард (1991). «Синий нативный электрофорез для изоляции комплексов мембранных белков в ферментативно активной форме». Аналитическая биохимия . 199 (2): 223–231. doi :10.1016/0003-2697(91)90094-A. PMID  1812789.
  6. ^ Виттиг, Илька; Браун, Ханс-Петер; Шеггер, Герман (2006). «Голубая родная СТРАНИЦА». Нат. Проток . 1 (1): 418–428. дои : 10.1038/nprot.2006.62. PMID  17406264. S2CID  19715017.
  7. ^ ab Wittig, Ilka; Schägger, Hermann (2005-10-11). "Преимущества и ограничения чистого нативного PAGE". Proteomics . 5 (17): 4338–4346. doi :10.1002/pmic.200500081. PMID  16220535. S2CID  23396231.
  8. ^ Гэвин, Пол Д.; Девениш, Родни Дж.; Прескотт, Марк (2003). «FRET выявляет изменения во взаимодействии F1–статорный стебель во время активности F1F0-АТФ-синтазы». Biochim Biophys Acta . 1607 (2–3): 167–79. doi : 10.1016/j.bbabio.2003.09.013 . PMID  14670607.
  9. ^ Кастенхольц, Бернд (2004). «Препаративный нативный непрерывный электрофорез в полиакриламидном геле (PNC-PAGE): эффективный метод выделения кофакторов кадмия в биологических системах». Analytical Letters . 37 (4): 657–665. doi :10.1081/AL-120029742. ISSN  0003-2719. S2CID  97636537.
  10. ^ Орнштейн, Леонард (декабрь 1964 г.). «Диск-электрофорез. I. Предпосылки и теория». Annals of the New York Academy of Sciences . 121 (2): 321–349. Bibcode : 1964NYASA.121..321O. CiteSeerX 10.1.1.140.7598 . doi : 10.1111/j.1749-6632.1964.tb14207.x. PMID  14240533. S2CID  28591995. 
  11. ^ Дэвис, Барух Дж. (декабрь 1964 г.). «Дискоэлектрофорез. 2. Метод и применение к белкам сыворотки человека». Анналы Нью-Йоркской академии наук . 121 (2): 404–427. Bibcode : 1964NYASA.121..404D. doi : 10.1111/j.1749-6632.1964.tb14213.x. PMID  14240539. S2CID  30512118.
  12. ^ Шеггер, Герман; фон Ягов, Гебхард (1987-11-01). "Электрофорез в полиакриламидном геле с трицин-додецилсульфатом натрия для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа". Аналитическая биохимия . 166 (2): 368–379. doi :10.1016/0003-2697(87)90587-2. ISSN  0003-2697. PMID  2449095.
  13. ^ Вилтфанг, Йенс; Арольд, Норберт; Нойхофф, Фолькер (1991). «Новая многофазная буферная система для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия белков и пептидов с молекулярными массами 100 000–1000 и их обнаружение с пикомолярной чувствительностью». Электрофорез . 12 (5): 352–366. doi :10.1002/elps.1150120507. ISSN  0173-0835. PMID  1718736. S2CID  40101706.
  14. ^ Кольрауш, Фридр (1897). «Ueber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen». Аннален дер Физик и Химия . 62 (10): 209–239. Бибкод : 1897АнП...298..209К. дои : 10.1002/andp.18972981002.
  15. ^ Вестермайер, Райнер (2016-05-02). Электрофорез на практике: руководство по методам и применению разделения ДНК и белков, A (5-е изд.). Wiley. стр. 43. doi :10.1002/9783527695188. ISBN 978-3-527-69518-8.
  16. ^ Вестермайер, Райнер (2016-02-26). Электрофорез на практике: руководство по методам и применению разделения ДНК и белков (5-е изд.). Wiley . doi :10.1002/9783527695188. ISBN 978-3-527-69518-8.
  17. ^ abc Сасс, Иоахим; Галлахер, Шон Р. (2009). «Окрашивание белков в гелях». Current Protocols in Molecular Biology . 85 (1): Unit 10.6. doi :10.1002/0471142727.mb1006s85. ISSN  1934-3639. PMID  19170026. S2CID  205153300.
  18. ^ ab Singer, Victoria L.; Haugland, Richard P. (1999). "Флуоресцентная визуализация нуклеиновых кислот и белков в гелях". Флуоресцентные и люминесцентные зонды для биологической активности (2-е изд.). Academic Press. стр. 58–61. doi :10.1016/b978-012447836-7/50006-3. ISBN 978-0-12-447836-7.
  19. ^ "In-gel Fluorescence". Azure Biosystems . Получено 2023-12-02 .
  20. ^ Вестермайер, Райнер (2016-05-02). Электрофорез на практике: руководство по методам и применению разделения ДНК и белков, A (5-е изд.). Wiley . стр. 2, 12, 121. doi :10.1002/9783527695188. ISBN 978-3-527-69518-8.

Внешние ссылки