Проводится ядерный run-on анализ для идентификации генов , которые транскрибируются в определенный момент времени. Примерно один миллион ядер клеток изолируется и инкубируется с мечеными нуклеотидами , а гены в процессе транскрибирования обнаруживаются путем гибридизации извлеченной РНК с ген-специфическими зондами на блоте . [ 1] Гарсия-Мартинес и др. (2004) [2] разработали протокол для дрожжей S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO), который позволяет рассчитывать скорости транскрипции (TR) для всех генов дрожжей, чтобы оценить стабильность мРНК для всех мРНК дрожжей. [3]
Недавно были разработаны альтернативные методы микрочипов, в основном PolII RIP-чип: иммунопреципитация РНК -полимеразы II с фосфорилированным C-концевым доменом, направленным антителами, и гибридизация на предметном стекле микрочипа или чипе (слово чип в названии происходит от "ChIP-chip", где требовался специальный Affymetrix GeneChip). Сравнение методов, основанных на run-on и ChIP-чипе, было проведено на дрожжах (Pelechano et al., 2009). Было обнаружено общее соответствие обоих методов, но GRO более чувствителен и количественен. Следует учитывать, что run-on обнаруживает только удлиняющиеся РНК-полимеразы, тогда как ChIP-чип обнаруживает все присутствующие РНК-полимеразы, включая отложенные.
Присоединение новой РНК-полимеразы к генам предотвращается включением саркозила . Поэтому только гены, которые уже имеют РНК-полимеразу, будут производить меченые транскрипты. РНК-транскрипты, которые были синтезированы до добавления метки, не будут обнаружены, поскольку у них не будет метки. Эти запущенные транскрипты также могут быть обнаружены путем очистки меченых транскриптов с использованием антител, которые обнаруживают метку, и гибридизации этих изолированных транскриптов с массивами экспрессии генов или с помощью секвенирования следующего поколения (GRO-Seq). [4]
Анализы Run on были в значительной степени вытеснены анализами Global Run on, которые используют секвенирование ДНК следующего поколения в качестве платформы для считывания. Эти анализы известны как GRO-Seq и обеспечивают невероятно подробный обзор генов, участвующих в транскрипции, с количественными уровнями экспрессии. Методы анализа Global Run on (GRO) на основе массивов заменяются на секвенирование следующего поколения, которое исключает разработку зондов против последовательностей генов. Секвенирование каталогизирует все полученные транскрипты, даже если они не зарегистрированы в базах данных. GRO-seq включает маркировку вновь синтезированных транскриптов бромуридином (BrU). Клетки или ядра инкубируются с BrUTP в присутствии саркозила , что предотвращает присоединение РНК-полимеразы к ДНК. Поэтому только РНК-полимераза, которая уже находится на ДНК до добавления саркозила, будет производить новые транскрипты, которые будут маркированы BrU. Помеченные транскрипты захватываются с помощью маркированных антителами анти-BrU бусин, преобразуются в кДНК, а затем секвенируются с помощью секвенирования ДНК следующего поколения. Затем считывания секвенирования выравниваются с геномом, а количество считываний на транскрипт обеспечивает точную оценку количества синтезированных транскриптов. [5]