Баланол — это грибковый метаболит , вырабатываемый грибом Verticillium balanoides . [1] Он является мощным ингибитором серин/треониновых протеинкиназ A (PKA) и протеинкиназы C (PKC), связываясь с ними аналогично АТФ . [2] Баланол был обнаружен в 1993 году в ходе поиска новых ингибиторов PKC, члена семейства серин/треониновых киназ, чрезмерная активация которых связана с многочисленными человеческими заболеваниями сигнальной трансдукции, включая рак. Однако большая часть исследований баланола сосредоточена на том, как химические модификации молекулярной структуры влияют на связывание с PKA. [3] Действительно, баланол, его химически измененные аналоги и их взаимодействия с PKA в частности используются для освещения роли селективности и гибкости белка в ингибировании киназ. Например, рентгеновская кристаллическая структура баланола в комплексе с PKA использовалась для придания селективности и улучшения фармакологической эффективности ингибиторов Akt H. sapiens ( PKB ), другой серин/треониновой протеинкиназы, участвующей в правильном функционировании многих клеточных процессов. [4]
Химическая структура была первоначально охарактеризована с помощью комбинации данных ИК-спектроскопии , ЯМР водорода-1 , ЯМР углерода-13 и спектров 2D ЯМР , а кристаллическая структура баланола в комплексе с PKA была решена в 1999 году. [5] Молекула баланола состоит из трех областей: бензофенона , гексагидроазепана и 4- гидроксибензоильного фрагмента. Бензофеноновые и гексагидроазепановые фрагменты связаны через эфирную связь, а азепановые и бензоильные фрагменты связаны через амидную связь. [6] Кроме того, баланол иногда называют офиокордином, противогрибковым средством, вырабатываемым грибом Cordyceps ophioglossoides , структура которого региоизометрична структуре баланола; то есть в офиокордине бензофенон связан с гексагидроазепаном через амид; 4-гидроксибензоильная группа и гексагидроазепан связаны сложноэфирной связью. [7]
Баланол является родственным АТФ , с различными областями его молекулярной структуры, способными образовывать связи, такие как адениновое кольцо, рибоза и фосфатные группы молекулы АТФ. В частности, 4-гидроксибензамидная часть баланола, включая амидный линкер, соответствует аденину АТФ, гексагидроазепановая часть - рибозной области, а бензофеноновые кольца - трифосфатам АТФ. [5]
Многочисленные конгенеры баланола были синтезированы с целью изучения влияния химических модификаций на связывание и специфичность киназы. Например, модификации бензофеноновых колец, аналогов фосфатных групп АТФ, производят необычайно мощные и специфические ингибиторы протеинкиназы. [6] Кроме того, многие из этих конгенеров баланола демонстрируют существенную специфичность к PKA по сравнению с PKC. Например, устранение гидроксильной группы из бензофенонового кольца (производство 10"-дезоксибаланола) вызывает селективность на два порядка большую для PKA по сравнению с PKC. [8] Также было показано, что мощная ингибирующая активность зависит от карбоксильной кислоты бензофенонового кольца и наличия пяти- или семичленного азепанового кольца. [3]
Гибкая структура баланола также играет важную роль в его селективности. В частности, дистальное бензофеноновое кольцо баланола способно вращаться. Фактически, в комплексе с PKA, дистальное бензофеноновое кольцо баланола, как было замечено, было почти ортогональным с соседним кольцом. [5] Эта гибкость может позволить баланолу адаптироваться к многочисленным белковым микроокружениям, чтобы оказывать свои ингибирующие свойства на различные протеинкиназы. Селективность баланола для некоторых киназ и отсутствие других, в свою очередь, может представлять собой различные степени гибкости, допускаемые каталитическими сайтами связывания АТФ этих киназ. [6]
Баланол является одним из самых мощных природных ингибиторов протеинкиназ PKC и PKA. [5] Первоначально было обнаружено, что баланол ингибирует PKC и многие ее изоформы у людей (α, β-Ι, β-ΙΙ, γ, δ, ε, η), с профилем ингибирования, аналогичным профилю стауроспорина . [1]
Баланол препятствует функционированию, конкурентно связываясь с каталитическим доменом PKC и PKA со сродством ( K i ≥ 4 нМ), на три порядка превышающим сродство к АТФ. [6] Без связанного АТФ эти киназы не способны катализировать перенос γ-фосфата от АТФ к целевому субстрату киназы, и, таким образом, функционирование затрудняется.
Связанный баланол простирается на 17,2 Å от гидроксильного атома кислорода его 4-гидроксибензамида до самого дистального карбоксильного атома кислорода его бензофеноновой части, помещаясь между большой и малой каталитическими долями PKA и простираясь от внутреннего края до внешнего устья АТФ-связывающей щели активного центра фермента. Богатая глицином петля щели и малая доля обеспечивают плотное, индуцированное связывание. [5]
Каждый подучасток АТФ-связывающего кармана в PKA занят заместителем молекулы баланола, как это наблюдалось в исследованиях рекомбинантной мышиной каталитической субъединицы PKA. [5] Адениновый подучасток PKA имеет гидрофобные компоненты и имеет потенциал отдавать и принимать электроны для создания водородных связей с одним или двумя плоскими циклическими кольцами. В частности, азот основной цепи Val123 и атом кислорода карбонила Glu121 могут образовывать водородные связи с единственной гидроксильной группой баланола 4-гидроксибензоильного фрагмента. В молекуле АТФ атом водорода амида Val123 принимает электроны от атома N1 пуринового кольца АТФ, в то время как атом кислорода карбонила основной цепи Glu121 отдает электроны атому N6 пуринового кольца АТФ. Миметики АТФ, такие как баланол, могут быть закреплены в гидрофобном аденин-связывающем кармане, поскольку их плоские заместители могут создавать благоприятные неполярные взаимодействия. Рибозный участок занят аксепановым кольцом баланола. В частности, атом N1 азепанового кольца образует водородные связи с атомом кислорода карбонила основной цепи Glu170 каталитической петли. Атомы внутри азепанового кольца также могут образовывать благоприятные неполярные контакты с остатками Gly50, Flu127 и Glu170. Хотя происходят и другие взаимодействия, большинство полярных и неполярных взаимодействий включают бензофеноновый заместитель баланола, который взаимодействует с остатками, составляющими фосфат-связывающий участок. Например, бензофеноновое кольцо баланола взаимодействует с многочисленными высококонсервативными остатками в PKA, такими как Gly52, Phe54, Asp184 и другими, в дополнение к различным неконсервативным остаткам, таким как Leu74 и Gln84. Большинство консервативных остатков в PKA взаимодействуют с АТФ, тогда как взаимодействия АТФ с неконсервативными остатками не происходят. [5]
Шесть упорядоченных молекул воды также играют критически важную роль в связывании баланола с PKA. Несколько остатков PKA, такие как Leu49 и Tyr330, связываются водородом с консервативными молекулами воды. Эти молекулы воды также опосредуют взаимодействия между баланолом и остатками каталитической щели PKA; например, две молекулы воды образуют мостик, позволяющий атому N1' баланола взаимодействовать с гидроксильной группой Tyr330. [5]
Однако тесное взаимодействие баланола с сайтом связывания АТФ, которое приводит к эффективности баланола как ингибитора, обусловлено не водородными связями, а скорее преобладающими неполярными взаимодействиями, которые создает молекула. Например, бензофеноновые кольца баланола расположены рядом с богатой глицином петлей и дальше от более полярной каталитической петли. По сравнению с трифосфатами АТФ, размещение бензофеноновых колец баланола вызывает перестройку каталитических боковых цепей Phe54 и Ser53, что обеспечивает благоприятные полярные и неполярные взаимодействия и, вероятно, способствует сильному ингибирующему эффекту баланола на эти киназы. [5]
Поскольку баланол действует специфически на сайт связывания АТФ в каталитическом ядре PKA и PKC, изначально предполагалось, что баланол может ингибировать все сериновые/треониновые киназы, разделяющие консервативный сайт связывания АТФ. Однако баланол не ингибирует все сериновые/треониновые киназы одинаково. Сродство к баланолу сильно варьируется (K i = 1,6–742 нМ), при этом несколько членов семейства сериновых/треониновых протеинкиназ вообще не подвергаются влиянию, хотя сродство этих киназ к АТФ варьируется незначительно (13–60 мкМ). [6] Баланол проявляет наиболее сильный ингибирующий эффект (K i = 1,6–6,4 нМ) на цГМФ-зависимую протеинкиназу ( PKG ), PKA и PKC, включая изоформы. [6] Он оказывает гораздо меньшее влияние (K i = 30 – 742 нМ), если вообще оказывает, на киназы, регулируемые Ca 2+ -кальмодулином, митоген-активирующую протеинкиназу (MAPK/Erk1) и некоторые циклин-зависимые киназы. [6] Кроме того, баланол не ингибирует две тирозиновые протеинкиназы, киназу SC и киназу рецептора эпидермального фактора роста. [2]