ДНК-полимераза I (или Pol I ) — это фермент , который участвует в процессе репликации ДНК прокариот . Открытая Артуром Корнбергом в 1956 году [1] , она была первой известной ДНК-полимеразой (и первой известной полимеразой любого типа ). Первоначально она была охарактеризована в E. coli и повсеместно встречается у прокариот . В E. coli и многих других бактериях ген , кодирующий Pol I, известен как polA . Фермент Pol I E. coli состоит из 928 аминокислот и является примером процессивного фермента — он может последовательно катализировать несколько этапов полимеризации, не высвобождая одноцепочечную матрицу. [2] Физиологическая функция Pol I в основном заключается в поддержке восстановления поврежденной ДНК, но она также способствует соединению фрагментов Оказаки путем удаления праймеров РНК и замены рибонуклеотидов ДНК.
В 1956 году Артур Корнберг и его коллеги открыли Pol I, используя экстракты Escherichia coli ( E. coli ) для разработки анализа синтеза ДНК. Ученые добавили меченый 14C тимидин, чтобы можно было извлечь радиоактивный полимер ДНК, а не РНК. Чтобы инициировать очистку ДНК-полимеразы, исследователи добавили сульфат стрептомицина к экстракту E. coli . Это разделило экстракт на супернатант без нуклеиновых кислот (S-фракция) и осадок, содержащий нуклеиновые кислоты (P-фракция). P-фракция также содержала Pol I и термостабильные факторы, необходимые для реакций синтеза ДНК. Эти факторы были идентифицированы как нуклеозидтрифосфаты , строительные блоки нуклеиновых кислот. S-фракция содержала несколько дезоксинуклеозидкиназ . [3] В 1959 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Артуру Корнбергу и Северо Очоа «за открытие механизмов, участвующих в биологическом синтезе рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты ». [4]
Pol I в основном функционирует при восстановлении поврежденной ДНК. Структурно Pol I является членом суперсемейства альфа/бета-белков, которое охватывает белки, в которых α-спирали и β-нити встречаются в нерегулярных последовательностях. ДНК Pol I E. coli состоит из нескольких доменов с тремя различными ферментативными активностями. Три домена, часто называемые доменами большого пальца, пальца и ладони, работают вместе для поддержания активности ДНК-полимеразы. [5] Четвертый домен рядом с доменом ладони содержит активный сайт экзонуклеазы , который удаляет неправильно включенные нуклеотиды в направлении от 3' до 5' в процессе, известном как корректура. Пятый домен содержит другой активный сайт экзонуклеазы , который удаляет ДНК или РНК в направлении от 5' до 3' и необходим для удаления праймера РНК во время репликации ДНК или ДНК во время процессов восстановления ДНК.
Бактерии E. coli продуцируют 5 различных ДНК-полимераз: DNA Pol I, DNA Pol II, DNA Pol III, DNA Pol IV и DNA Pol V. [6]
При репликации ДНК ведущая цепь ДНК непрерывно удлиняется в направлении движения репликативной вилки, тогда как отстающая цепь ДНК движется прерывисто в противоположном направлении, как фрагменты Оказаки . [7] ДНК-полимеразы также не могут инициировать цепи ДНК, поэтому они должны инициироваться короткими сегментами РНК или ДНК, известными как праймеры. [5] Для того чтобы произошла полимеризация ДНК, должны быть выполнены два требования. Прежде всего, все ДНК-полимеразы должны иметь как матричную цепь, так и праймерную цепь. В отличие от РНК, ДНК-полимеразы не могут синтезировать ДНК из матричной цепи. Синтез должен быть инициирован коротким сегментом РНК, известным как праймер РНК , синтезированным Праймазой в направлении от 5' к 3'. Затем синтез ДНК происходит путем добавления dNTP к 3'-гидроксильной группе на конце уже существующей цепи ДНК или праймера РНК. Во-вторых, ДНК-полимеразы могут добавлять новые нуклеотиды к уже существующей цепи только посредством водородных связей. [6] Поскольку все ДНК-полимеразы имеют схожую структуру, все они имеют механизм полимеразы, катализируемый двумя ионами металлов. Один из ионов металла активирует гидроксильную группу праймера 3', которая затем атакует первичный 5' фосфат dNTP. Второй ион металла стабилизирует отрицательный заряд выходящего кислорода и впоследствии хелатирует две выходящие фосфатные группы. [8]
Рентгеновские кристаллические структуры доменов полимеразы ДНК-полимераз описываются по аналогии с правыми руками человека. Все ДНК-полимеразы содержат три домена. Первый домен, который известен как «домен пальцев», взаимодействует с dNTP и парным основанием шаблона. «Домен пальцев» также взаимодействует с шаблоном, чтобы правильно расположить его в активном центре. [9] Известный как «домен ладони», второй домен катализирует реакцию переноса фосфорильной группы. Наконец, третий домен, который известен как «домен большого пальца», взаимодействует с двухцепочечной ДНК. [10] Экзонуклеазный домен содержит свой собственный каталитический центр и удаляет неправильно спаренные основания. Среди семи различных семейств ДНК-полимераз «домен ладони» сохраняется в пяти из этих семейств. «Домен пальца» и «домен большого пальца» не совпадают в каждом семействе из-за различных элементов вторичной структуры из разных последовательностей. [9]
Pol I обладает четырьмя ферментативными активностями:
Чтобы определить, использовался ли Pol I в первую очередь для репликации ДНК или для восстановления повреждений ДНК, был проведен эксперимент с мутантным штаммом E. coli с дефицитом Pol I. Мутантный штамм, в котором отсутствовал Pol I, был изолирован и обработан мутагеном. Мутантный штамм развил бактериальные колонии, которые продолжали нормально расти и в которых также отсутствовал Pol I. Это подтвердило, что Pol I не требуется для репликации ДНК. Однако мутантный штамм также продемонстрировал характеристики, которые включали крайнюю чувствительность к определенным факторам, которые повреждали ДНК, таким как УФ-излучение . Таким образом, это подтвердило, что Pol I, скорее всего, участвует в восстановлении повреждений ДНК, а не в репликации ДНК. [6]
В процессе репликации РНКаза H удаляет РНК- праймер (созданную праймазой ) из отстающей цепи , а затем полимераза I заполняет необходимые нуклеотиды между фрагментами Оказаки (см. Репликация ДНК ) в направлении 5'→3', по ходу дела исправляя ошибки. Это фермент, зависящий от матрицы — он добавляет только те нуклеотиды, которые правильно спариваются с существующей цепью ДНК, выступающей в качестве матрицы. Крайне важно, чтобы эти нуклеотиды находились в правильной ориентации и геометрии для спаривания с цепью матрицы ДНК, чтобы ДНК-лигаза могла соединить различные фрагменты вместе в непрерывную цепь ДНК . Исследования полимеразы I подтвердили, что различные dNTP могут связываться с одним и тем же активным сайтом на полимеразе I. Полимераза I способна активно различать различные dNTP только после того, как она претерпит конформационное изменение . После того, как это изменение произошло, Pol I проверяет правильную геометрию и правильное выравнивание пары оснований, образованной между связанным dNTP и соответствующим основанием на шаблонной нити. Правильная геометрия пар оснований A=T и G≡C — единственные, которые могут поместиться в активном сайте . Однако важно знать, что один из каждых 10 4 — 10 5 нуклеотидов добавляется неправильно. Тем не менее, Pol I может исправить эту ошибку в репликации ДНК, используя свой селективный метод активной дискриминации. [5]
Несмотря на раннюю характеристику, быстро стало очевидно, что полимераза I не является ферментом, ответственным за большую часть синтеза ДНК — репликация ДНК в E. coli происходит со скоростью приблизительно 1000 нуклеотидов в секунду, в то время как скорость синтеза пар оснований полимеразой I в среднем составляет всего от 10 до 20 нуклеотидов в секунду. Более того, ее клеточная распространенность, составляющая приблизительно 400 молекул на клетку, не коррелирует с тем фактом, что в E. coli обычно имеется только две репликационные вилки . Кроме того, она недостаточно процессивна для копирования всего генома , поскольку отпадает после включения всего 25–50 нуклеотидов . Ее роль в репликации была доказана, когда в 1969 году Джон Кэрнс выделил жизнеспособный мутант полимеразы I , у которого отсутствовала полимеразная активность. [12] Лаборантка Кэрнса, Паула Де Люсия, создала тысячи бесклеточных экстрактов из колоний E. coli и исследовала их на ДНК-полимеразную активность. 3478-й клон содержал мутант polA , который Кэрнс назвал в честь «Паулы» [Де Люсия]. [13] Только после открытия ДНК-полимеразы III была окончательно идентифицирована основная репликативная ДНК-полимераза.
ДНК-полимераза I, полученная из E. coli , широко используется для исследований в области молекулярной биологии . Однако 5'→3' экзонуклеазная активность делает ее непригодной для многих приложений. Эту нежелательную ферментативную активность можно просто удалить из голофермента, чтобы оставить полезную молекулу, называемую фрагментом Кленова , широко используемую в молекулярной биологии . Фактически, фрагмент Кленова использовался во время первых протоколов амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), пока в 1976 году не был открыт Thermus aquaticus , источник термоустойчивой Taq -полимеразы I. [15] Воздействие протеазы субтилизина на ДНК-полимеразу I расщепляет молекулу на меньший фрагмент, который сохраняет только ДНК-полимеразную и корректирующую активности.
{{cite journal}}: Цитировать журнал требует |journal=( помощь )