Двумерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса ( 2D ЯМР ) — это набор методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые дают данные, нанесенные на график в пространстве, определяемом двумя частотными осями, а не одной. Типы 2D ЯМР включают корреляционную спектроскопию (COSY), J-спектроскопию , обменную спектроскопию (EXSY) и спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY). Двумерные спектры ЯМР предоставляют больше информации о молекуле, чем одномерные спектры ЯМР, и особенно полезны для определения структуры молекулы , особенно для молекул, которые слишком сложны для работы с использованием одномерного ЯМР.
Первый двумерный эксперимент, COSY, был предложен Жаном Дженером , профессором Брюссельского свободного университета, в 1971 году. Этот эксперимент позже был реализован Уолтером П. Ауэ, Энрико Бартольди и Ричардом Р. Эрнстом , которые опубликовали свою работу в 1976 году. [1] [2] [3]
Каждый эксперимент состоит из последовательности радиочастотных (РЧ) импульсов с периодами задержки между ними. Время, частоты и интенсивности этих импульсов отличают различные эксперименты ЯМР друг от друга. [4] Почти все двумерные эксперименты имеют четыре этапа: период подготовки, где когерентность намагничивания создается с помощью набора РЧ импульсов; период эволюции, определенный промежуток времени, в течение которого импульсы не доставляются, а ядерные спины могут свободно прецессировать (вращаться); период смешивания, где когерентность манипулируется другой серией импульсов в состояние, которое даст наблюдаемый сигнал; и период обнаружения, в котором сигнал затухания свободной индукции от образца наблюдается как функция времени, аналогично одномерному ЯМР-ФП. [5]
Два измерения двумерного эксперимента ЯМР — это две оси частот, представляющие химический сдвиг. Каждая ось частот связана с одной из двух временных переменных, которые представляют собой длину периода эволюции ( время эволюции ) и время, прошедшее в течение периода обнаружения ( время обнаружения ). Каждый из них преобразуется из временного ряда в частотный ряд посредством двумерного преобразования Фурье . Один двумерный эксперимент генерируется как серия одномерных экспериментов с различным определенным временем эволюции в последовательных экспериментах, при этом вся продолжительность периода обнаружения регистрируется в каждом эксперименте. [5]
Конечным результатом является график, показывающий значение интенсивности для каждой пары частотных переменных. Интенсивности пиков в спектре могут быть представлены с использованием третьего измерения. Чаще всего интенсивность обозначается с помощью контурных линий или разных цветов.
В этих методах передача намагниченности происходит между ядрами одного типа посредством J-связей ядер, соединенных несколькими связями.
Первый и самый популярный эксперимент двумерного ЯМР — это последовательность гомоядерной корреляционной спектроскопии (COSY), которая используется для идентификации спинов, связанных друг с другом. Она состоит из одного импульса RF (p1), за которым следует определенное время эволюции (t1), за которым следует второй импульс (p2), за которым следует период измерения (t2). [6]
Двумерный спектр, полученный в результате эксперимента COSY, показывает частоты для одного изотопа , чаще всего водорода ( 1 H) вдоль обеих осей. (Были также разработаны методы для генерации гетероядерных корреляционных спектров, в которых две оси соответствуют разным изотопам, таким как 13 C и 1 H.) Диагональные пики соответствуют пикам в эксперименте 1D-ЯМР, в то время как кросс-пики указывают на связи между парами ядер (подобно тому, как расщепление мультиплета указывает на связи в 1D-ЯМР). [6]
Перекрестные пики возникают в результате явления, называемого переносом намагниченности , и их присутствие указывает на то, что два ядра связаны, и имеют два разных химических сдвига, которые составляют координаты перекрестного пика. Каждое соединение дает два симметричных перекрестных пика выше и ниже диагонали. То есть перекрестный пик возникает, когда существует корреляция между сигналами спектра вдоль каждой из двух осей при этих значениях. Простой визуальный способ определить, какие связи представляет перекрестный пик, — это найти диагональный пик, который находится непосредственно выше или ниже перекрестного пика, и другой диагональный пик, который находится непосредственно слева или справа от перекрестного пика. Ядра, представленные этими двумя диагональными пиками, связаны. [6]
COSY-90 — наиболее распространенный эксперимент COSY. В COSY-90 импульс p1 наклоняет ядерный спин на 90°. Еще одним членом семейства COSY является COSY-45 . В COSY-45 вместо 90° импульса для второго импульса p2 используется импульс 45°. Преимущество COSY-45 заключается в том, что диагональные пики менее выражены, что упрощает сопоставление кросс-пиков вблизи диагонали в большой молекуле. Кроме того, относительные знаки констант связи (см. J-связь#Маттенция J-связь ) можно выяснить из спектра COSY-45. Это невозможно при использовании COSY-90. [7] В целом, COSY-45 предлагает более чистый спектр, в то время как COSY-90 более чувствителен.
Другой родственный метод COSY — это метод двойной квантовой фильтрации (DQF) COSY. DQF COSY использует метод выбора когерентности, такой как фазовое циклирование или градиенты импульсного поля , которые заставляют только сигналы от двухквантовых когерентностей давать наблюдаемый сигнал. Это приводит к уменьшению интенсивности диагональных пиков и изменению их формы линии с широкой «дисперсионной» на более резкую «абсорбционную». Это также устраняет диагональные пики от несвязанных ядер. Все они имеют то преимущество, что они дают более чистый спектр, в котором диагональные пики не могут затмевать перекрестные пики, которые слабее в обычном спектре COSY. [8]
Эксперимент TOCSY похож на эксперимент COSY, в котором наблюдаются кросс-пики связанных протонов. Однако кросс-пики наблюдаются не только для ядер, которые связаны напрямую, но и между ядрами, которые связаны цепочкой связей. Это делает его полезным для идентификации более крупных взаимосвязанных сетей спиновых связей. Эта способность достигается путем вставки повторяющейся серии импульсов, которые вызывают изотропное смешивание в течение периода смешивания. Более длительное время изотропного смешивания заставляет поляризацию распространяться через все большее число связей. [9]
В случае олигосахаридов каждый остаток сахара представляет собой изолированную спиновую систему, поэтому можно дифференцировать все протоны определенного остатка сахара. Также доступна 1D-версия TOCSY, и при облучении одного протона можно выявить остальную часть спиновой системы. Последние достижения в этой технике включают эксперимент TOCSY 1D-CSSF (селективный фильтр химического сдвига), который производит спектры более высокого качества и позволяет надежно извлекать константы связи и использовать их для определения стереохимии.
TOCSY иногда называют «гомоядерной спектроскопией Гартмана–Хана» (HOHAHA). [10]
INADEQUATE [11] — это метод, часто используемый для поиска связей 13 C между соседними атомами углерода. Поскольку естественное содержание 13 C составляет всего около 1%, только около 0,01% изучаемых молекул будут иметь два соседних атома 13 C, необходимых для сигнала в этом эксперименте. Однако методы корреляционного отбора используются (аналогично DQF COSY) для предотвращения сигналов от одиночных атомов 13 C, так что двойные сигналы 13 C могут быть легко разрешены. Каждая связанная пара ядер дает пару пиков в спектре INADEQUATE, которые оба имеют одну и ту же вертикальную координату, которая является суммой химических сдвигов ядер; горизонтальная координата каждого пика является химическим сдвигом для каждого из ядер в отдельности. [12]
Гетероядерная корреляционная спектроскопия дает сигнал, основанный на связи между ядрами двух разных типов. Часто два ядра являются протонами и другим ядром (называемым «гетероядром»). По историческим причинам эксперименты, которые регистрируют протонный, а не гетероядерный спектр в течение периода обнаружения, называются «обратными» экспериментами. Это связано с тем, что низкая естественная распространенность большинства гетероядер привела бы к тому, что протонный спектр был бы перегружен сигналами от молекул без активных гетероядер, что сделало бы его бесполезным для наблюдения желаемых, связанных сигналов. С появлением методов подавления этих нежелательных сигналов эксперименты с обратной корреляцией, такие как HSQC, HMQC и HMBC, на самом деле стали гораздо более распространенными сегодня. «Нормальная» гетероядерная корреляционная спектроскопия, в которой регистрируется гетероядерный спектр, известна как HETCOR. [13]
HSQC обнаруживает корреляции между ядрами двух разных типов, которые разделены одной связью. Этот метод дает один пик на пару связанных ядер, две координаты которых являются химическими сдвигами двух связанных атомов. [15]
HSQC работает путем передачи намагниченности от ядра I (обычно протона) к ядру S (обычно гетероатому) с использованием последовательности импульсов INEPT ; этот первый шаг выполняется, поскольку протон имеет большую равновесную намагниченность, и, таким образом, этот шаг создает более сильный сигнал. Затем намагниченность эволюционирует и затем передается обратно в ядро I для наблюдения. Затем может быть опционально использован дополнительный шаг спинового эха для разделения сигнала, упрощая спектр путем схлопывания мультиплетов до одного пика. Нежелательные несвязанные сигналы удаляются путем проведения эксперимента дважды с обратной фазой одного конкретного импульса; это меняет знаки желаемых, но не нежелательных пиков, поэтому вычитание двух спектров даст только желаемые пики. [15]
Гетероядерная многоквантовая корреляционная спектроскопия (HMQC) дает идентичный спектр, как HSQC, но с использованием другого метода. Оба метода дают схожие качественные результаты для молекул малого и среднего размера, но HSQC считается лучшим для более крупных молекул. [15]
HMBC обнаруживает гетероядерные корреляции в более длинных диапазонах около 2–4 связей. Трудность обнаружения корреляций с несколькими связями заключается в том, что последовательности HSQC и HMQC содержат определенное время задержки между импульсами, что позволяет обнаруживать только диапазон вокруг определенной константы связи. Это не проблема для методов с одной связью, поскольку константы связи, как правило, лежат в узком диапазоне, но константы связи с несколькими связями охватывают гораздо более широкий диапазон и не могут быть все зафиксированы в одном эксперименте HSQC или HMQC. [16]
В HMBC эта трудность преодолевается путем исключения одной из этих задержек из последовательности HMQC. Это увеличивает диапазон констант связи, которые могут быть обнаружены, а также уменьшает потерю сигнала из-за релаксации. Цена заключается в том, что это исключает возможность разделения спектра и вносит фазовые искажения в сигнал. Существует модификация метода HMBC, которая подавляет сигналы с одной связью, оставляя только сигналы с несколькими связями. [16]
Эти методы устанавливают корреляции между ядрами, которые физически близки друг к другу, независимо от того, есть ли между ними связь. Они используют ядерный эффект Оверхаузера (NOE), при котором соседние атомы (в пределах примерно 5 Å) подвергаются кросс-релаксации посредством механизма, связанного со спин-решеточной релаксацией .
В NOESY ядерная кросс-релаксация Оверхаузера между ядерными спинами в течение периода смешивания используется для установления корреляций. Полученный спектр похож на COSY, с диагональными пиками и кросс-пиками, однако кросс-пики связывают резонансы от ядер, которые пространственно близки, а не те, которые связаны друг с другом через связь. Спектры NOESY также содержат дополнительные аксиальные пики , которые не дают дополнительной информации и могут быть устранены с помощью другого эксперимента путем изменения фазы первого импульса. [17]
Одним из применений NOESY является изучение крупных биомолекул, например, в ЯМР-спектроскопии белков , где взаимосвязи часто можно определить с помощью последовательного обхода .
Эксперимент NOESY также может быть выполнен в одномерном режиме путем предварительного выбора отдельных резонансов. Спектры считываются с предварительно выбранными ядрами, дающими большой отрицательный сигнал, в то время как соседние ядра идентифицируются более слабыми положительными сигналами. Это показывает только, какие пики имеют измеримые NOE для интересующего резонанса, но занимает гораздо меньше времени, чем полный 2D эксперимент. Кроме того, если предварительно выбранное ядро меняет среду в пределах временной шкалы эксперимента, могут наблюдаться множественные отрицательные сигналы. Это обеспечивает обмен информацией, аналогичный методу EXSY (обменная спектроскопия) ЯМР.
Эксперименты NOESY являются важным инструментом для определения стереохимии молекулы в растворителе, тогда как рентгеновская дифракция на монокристалле используется для определения стереохимии молекулы в твердом состоянии.
В HOESY, во многом похоже на NOESY, используется для кросс-релаксации между ядерными спинами. Однако HOESY может предоставлять информацию о других активных ядрах ЯМР в пространственно релевантной манере. Примерами являются любые ядра X{Y} или X→Y, такие как 1 H→ 13 C, 19 F→ 13 C, 31 P→ 13 C или 77 Se→ 13 C. Эксперименты обычно наблюдают NOE от протонов на X, X{ 1 H}, но не обязательно включают протоны. [18]
ROESY похож на NOESY, за исключением того, что начальное состояние отличается. Вместо наблюдения кросс-релаксации из начального состояния z -намагниченности, равновесная намагниченность вращается на ось x , а затем спин-локируется внешним магнитным полем, так что она не может прецессировать. Этот метод полезен для определенных молекул, время вращательной корреляции которых попадает в диапазон, где ядерный эффект Оверхаузера слишком слаб, чтобы быть обнаруженным, обычно молекул с молекулярной массой около 1000 дальтон , поскольку ROESY имеет другую зависимость между временем корреляции и константой скорости кросс-релаксации. В NOESY константа скорости кросс-релаксации меняется с положительной на отрицательную по мере увеличения времени корреляции, давая диапазон, где она близка к нулю, тогда как в ROESY константа скорости кросс-релаксации всегда положительна. [19] [20]
ROESY иногда называют «перекрестной релаксацией, подходящей для минимолекул, эмулируемых заблокированными спинами» (CAMELSPIN). [20]
В отличие от коррелированных спектров, разрешенные спектры разносят пики в эксперименте 1D-ЯМР в два измерения без добавления дополнительных пиков. Эти методы обычно называют спектроскопией с разрешением J, но иногда их также называют спектроскопией с разрешением химического сдвига или спектроскопией с разрешением δ. Они полезны для анализа молекул, для которых спектры 1D-ЯМР содержат перекрывающиеся мультиплеты, поскольку спектр с разрешением J вертикально смещает мультиплет от каждого ядра на разную величину. Каждый пик в спектре 2D будет иметь ту же горизонтальную координату, что и в неразвязанном спектре 1D, но его вертикальная координата будет химическим сдвигом одного пика, который ядро имеет в развязанном спектре 1D. [21]
Для гетероядерной версии простейшая используемая последовательность импульсов называется экспериментом Мюллера–Кумара–Эрнста (MKE), который имеет один 90° импульс для гетероядра для периода подготовки, без периода смешивания и применяет сигнал развязки к протону во время периода обнаружения. Существует несколько вариантов этой последовательности импульсов, которые более чувствительны и точны, которые попадают в категории методов стробируемой развязки и методов спин-флипа . Гомоядерная J-разрешенная спектроскопия использует последовательность импульсов спинового эха . [21]
Также можно проводить 3D и 4D эксперименты, иногда запуская последовательности импульсов из двух или трех 2D экспериментов подряд. Однако многие из обычно используемых 3D экспериментов являются экспериментами с тройным резонансом ; примерами служат эксперименты HNCA и HNCOCA , которые часто используются в ЯМР белков .