В биохимии и молекулярной генетике сайт AP ( апуриновый/апиримидиновый сайт ), также известный как абазический сайт , представляет собой участок в ДНК (также в РНК , но гораздо реже), который не имеет ни пуринового , ни пиримидинового основания, ни спонтанно, ни из-за повреждения ДНК . Было подсчитано, что в физиологических условиях в клетке ежедневно может образовываться 10 000 апуриновых сайтов и 500 апиримидиновых. [1] [2]
Сайты AP могут быть образованы путем спонтанной депуринизации , но также встречаются как промежуточные продукты в репарации удаления оснований . [3] В этом процессе ДНК-гликозилаза распознает поврежденное основание и расщепляет N-гликозидную связь, чтобы высвободить основание, оставляя сайт AP. Существует множество гликозилаз, которые распознают различные типы повреждений, включая окисленные или метилированные основания или урацил в ДНК. Сайт AP затем может быть расщеплен эндонуклеазой AP , оставляя 3'-гидроксильные и дезоксирибозо-5-фосфатные концы (см. Структура ДНК ). Альтернативным способом бифункциональные гликозилазы-лиазы могут расщеплять сайт AP, оставляя 5'-фосфат рядом с 3' α,β-ненасыщенным альдегидом. Оба механизма образуют одноцепочечный разрыв, который затем восстанавливается либо путем репарации удаления оснований с короткими заплатками, либо с помощью репарации удаления оснований с длинными заплатками. [4]
Если оставить сайты AP неисправленными, они могут привести к мутации во время полуконсервативной репликации . Они могут вызвать остановку репликативной вилки и обойдены транслезионным синтезом . В E. coli аденин предпочтительно вставляется напротив сайтов AP, что известно как «правило A». Ситуация более сложная у высших эукариот, где различные нуклеотиды демонстрируют предпочтение в зависимости от организма и экспериментальных условий. [3]
AP-сайты образуются, когда дезоксирибоза отщепляется от своего азотистого основания , разрушая гликозидную связь между ними. Это может произойти спонтанно, в результате химической активности, радиации или из-за активности фермента. Гликозидные связи в ДНК могут быть разорваны посредством кислотно -катализируемого гидролиза . Пуриновые основания могут быть выброшены в слабокислых условиях, в то время как пиримидины требуют более высокой кислотности для расщепления. Пурины могут быть даже удалены при нейтральном pH , если температура достаточно повышается. Образование AP-сайта также может быть вызвано различными химическими веществами, модифицирующими основания. Алкилирование , дезаминирование и окисление отдельных оснований могут привести к ослаблению гликозильной связи, поэтому воздействие агентов, вызывающих эти модификации, может способствовать образованию AP-сайта. [2]
Ионизирующее излучение также может привести к образованию AP-сайта. Облученные среды содержат радикалы, которые могут способствовать образованию AP-сайтов несколькими способами. Гидроксильные радикалы могут атаковать гликозидные связи, напрямую создавая AP-сайт, или делать гликозильную связь менее благоприятной, связываясь с основанием или дезоксирибозным кольцом. [2]
Ферменты, а именно ДНК-гликозилазы, также обычно создают AP-сайты как часть базового пути эксцизионной репарации. По оценкам, в данной клетке млекопитающего в день образуется 5000–10 000 апуриновых сайтов. Апиримидиновые сайты образуются примерно в 20 раз медленнее, по оценкам, около 500 событий образования в день на клетку. При таких высоких скоростях для клеток критически важно иметь надежный аппарат репарации, чтобы предотвратить мутацию.
AP-сайты чрезвычайно реактивны. Они колеблются между фуранозным кольцом и конформацией свободного альдегида и свободного спирта с открытой цепью . Воздействие нуклеофила может вызвать реакцию β-элиминирования, в которой 3'- фосфоэфирная связь разрывается, вызывая одноцепочечный разрыв. Эта реакция может катализироваться AP-лиазой . [2] При наличии избытка реагента может происходить дополнительное элиминирование на 5'-стороне. Свободный альдегид также может реагировать с нуклеофильными аминосодержащими альдегидами. Эти реакции могут дополнительно способствовать разрыву фосфоэфирной связи. Альдегиды, содержащие группы O-HN 2, могут служить для стабилизации абазического сайта, реагируя с альдегидной группой. Это взаимодействие не разрывает фосфоэфирную связь.
AP-сайты в живых клетках могут вызывать различные и серьезные последствия, включая гибель клетки. Одноцепочечные разрывы, возникающие из-за β-элиминации, требуют восстановления ДНК-лигазой , чтобы избежать мутации. Когда ДНК-полимераза сталкивается с абазическим сайтом, репликация ДНК обычно блокируется, что само по себе может привести к одноцепочечному или двухцепочечному разрыву в спирали ДНК. [4] В E. coli , когда ферменту удается обойти абазический сайт, аденин предпочтительно включается в новую цепь. [2] [3] Если AP-сайты в ДНК не восстановлены, репликация ДНК не может нормально проходить, и могут возникнуть значительные мутации. [4] Если мутации представляют собой просто однонуклеотидные полиморфизмы , то клетка потенциально может быть не затронута. Однако, если происходят более серьезные мутации, функция клетки может быть серьезно нарушена, рост и деление могут быть нарушены, или клетка может просто умереть.
Сайты AP являются важной особенностью пути репарации эксцизионной репарации оснований. ДНК-гликозилазы сначала создают абазические сайты, распознавая и удаляя модифицированные основания. Существует множество вариантов гликозилаз, которые справляются с несколькими способами повреждения основания. Наиболее распространенными обстоятельствами являются алкилирование оснований, окисление и присутствие урацила в цепи ДНК. [4] После успешного создания сайта AP эндонуклеаза AP катализирует разрыв одной фосфоэфирной связи, создавая надрез в остове спирали. [4] Разрыв может быть как 3', так и 5' сайта, в зависимости от варианта фермента. Затем ферменты конечной обработки подготавливают сайт для лигирования надреза, которое выполняется ДНК-полимеразой. [4] Основание, вставленное в надрез, определяется соответствующим основанием на противоположной цепи. Затем надрез запечатывается ДНК-лигазой.
Активность эндонуклеазы AP в восстановлении участков AP в лобной/теменной коре, мозжечке , стволе мозга , среднем мозге и гипоталамусе снижается с возрастом у крыс, находящихся на диете ad libitum . [5] Для сравнения, у крыс с ограничением калорий активность эндонуклеазы AP в этих областях мозга остается более высокой с возрастом. [5] Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенное восстановление участков AP у животных с ограничением калорий может замедлить процесс старения.