BRAF — это человеческий ген , который кодирует белок B-Raf. Ген также называют протоонкогеном B-Raf и гомологом вирусного онкогена мышиной саркомы v-Raf B , в то время как сам белок более формально известен как серин/треонин-протеинкиназа B-Raf . [5] [6]
Белок B-Raf участвует в отправке сигналов внутри клеток, которые участвуют в управлении ростом клеток . В 2002 году было показано, что он мутирует в некоторых видах рака у человека . [7]
Некоторые другие наследственные мутации BRAF вызывают врожденные дефекты.
Разработаны препараты для лечения рака, вызванного мутациями BRAF . Два из этих препаратов, вемурафениб [8] и дабрафениб , одобрены FDA для лечения меланомы поздней стадии. Вемурафениб был первым одобренным препаратом, полученным в результате фрагментного открытия лекарств . [9]
B-Raf является членом семейства киназ Raf протеинкиназ передачи сигнала роста . Этот белок играет роль в регуляции сигнального пути MAP киназы / ERK , который влияет на деление клеток , дифференциацию и секрецию. [10]
B-Raf — это 766- аминокислотная , регулируемая сигнальная трансдукция серин/треонин-специфическая протеинкиназа . В общих чертах, она состоит из трех консервативных доменов, характерных для семейства киназ Raf : консервативная область 1 (CR1), саморегулируемый домен связывания Ras - GTP [ 11] , консервативная область 2 (CR2), богатая серином шарнирная область, и консервативная область 3 (CR3), каталитический домен протеинкиназы , который фосфорилирует консенсусную последовательность на белковых субстратах. [12] В своей активной конформации B-Raf образует димеры посредством водородных связей и электростатических взаимодействий своих киназных доменов. [13]
Консервативный регион 1 (CR1) аутоингибирует домен киназы B-Raf (CR3), так что сигнализация B-Raf регулируется, а не конститутивна. [12] Остатки 155–227 [14] составляют домен связывания Ras (RBD), который связывается с эффекторным доменом Ras-GTP для высвобождения CR1 и остановки ингибирования киназы. Остатки 234–280 составляют мотив цинкового пальца, связывающего форболовый эфир/ DAG , который участвует в стыковке мембраны B-Raf после связывания Ras. [14] [15]
Консервативная область 2 (CR2) обеспечивает гибкий линкер, который соединяет CR1 и CR3 и действует как шарнир. [16]
Консервативная область 3 (CR3), остатки 457–717, [14] составляет домен ферментативной киназы B-Raf. Эта в значительной степени консервативная структура [17] является двухдольной, соединенной короткой шарнирной областью. [18] Меньшая N -доля (остатки 457–530) в первую очередь отвечает за связывание АТФ , тогда как большая C -доля (остатки 535–717) связывает субстратные белки. [17] Активный центр представляет собой щель между двумя долями, а каталитический остаток Asp 576 расположен на C-доле, обращенной внутрь этой щели. [14] [17]
P -петля B-Raf (остатки 464–471) стабилизирует непереносимые фосфатные группы АТФ во время связывания фермента АТФ. В частности, амиды основной цепи S 467, F 468 и G 469 образуют водородную связь с β-фосфатом АТФ, чтобы закрепить молекулу. Функциональные мотивы B-Raf были определены путем анализа гомологии PKA, проанализированной Хэнксом и Хантером, с доменом киназы B-Raf. [17]
V 471, C 532, W 531, T 529, L 514 и A 481 образуют гидрофобный карман, внутри которого аденин АТФ закрепляется посредством притяжения Ван-дер-Ваальса при связывании АТФ. [17] [19]
Остатки 574–581 составляют часть домена киназы, ответственную за поддержку переноса γ-фосфата АТФ на белковый субстрат B-Raf. В частности, D 576 действует как акцептор протонов для активации нуклеофильного гидроксильного кислорода на остатках серина или треонина субстрата, позволяя реакции переноса фосфата происходить с помощью основного катализа . [17]
D 594, F 595 и G 596 составляют мотив, центральный для функции B-Raf как в неактивном, так и в активном состоянии. В неактивном состоянии F595 занимает нуклеотидсвязывающий карман, запрещая АТФ проникать и снижая вероятность ферментативного катализа. [13] [19] [20] В активном состоянии D594 хелатирует двухвалентный катион магния , который стабилизирует β- и γ-фосфатные группы АТФ, ориентируя γ-фосфат для переноса. [17 ]
Остатки 596–600 образуют сильные гидрофобные взаимодействия с P-петлей в неактивной конформации киназы, блокируя киназу в ее неактивном состоянии до тех пор, пока активационная петля не фосфорилируется, дестабилизируя эти взаимодействия при наличии отрицательного заряда. Это запускает переход киназы в активное состояние. В частности, L597 и V600 активационной петли взаимодействуют с G466, F468 и V471 P-петли, сохраняя домен киназы неактивным до тех пор, пока он не фосфорилируется. [18]
B-Raf — это серин/треонин-специфическая протеинкиназа . Как таковая, она катализирует фосфорилирование остатков серина и треонина в консенсусной последовательности на целевых белках с помощью АТФ , давая АДФ и фосфорилированный белок в качестве продуктов. [17] Поскольку это высокорегулируемая киназа сигнальной трансдукции , B-Raf сначала должна связать Ras - GTP, прежде чем стать активной как фермент. [15] После активации B-Raf консервативное каталитическое ядро протеинкиназы фосфорилирует белковые субстраты, способствуя нуклеофильной атаке активированного субстрата серина или треонина гидроксильного атома кислорода на γ-фосфатную группу АТФ посредством бимолекулярного нуклеофильного замещения . [17] [21] [22] [23]
Домен киназы (CR3) человеческих Raf-киназ ингибируется двумя механизмами: аутоингибированием его собственным регуляторным Ras - GTP -связывающим доменом CR1 и отсутствием посттрансляционного фосфорилирования ключевых остатков серина и тирозина (S338 и Y341 для c-Raf) в шарнирной области CR2. Во время активации B-Raf аутоингибирующий домен CR1 белка сначала связывает эффекторный домен Ras-GTP с Ras-связывающим доменом CR1 (RBD), чтобы высвободить домен киназы CR3, как и другие члены семейства человеческих Raf-киназ . Взаимодействие CR1-Ras позднее усиливается за счет связывания богатого цистеином субдомена (CRD) CR1 с Ras и мембранными фосфолипидами . [12] В отличие от A-Raf и C-Raf , которые должны быть фосфорилированы на гидроксильных остатках CR2 перед полным высвобождением CR1 для того, чтобы стать активными, B-Raf конститутивно фосфорилируется на CR2 S445. [24] Это позволяет отрицательно заряженному фосфосерину немедленно отталкивать CR1 посредством стерических и электростатических взаимодействий после того, как регуляторный домен освобождается, освобождая домен киназы CR3 для взаимодействия с субстратными белками.
После высвобождения аутоингибиторного регуляторного домена CR1 домен киназы CR3 B-Raf должен измениться на свой активный конформер , связывающий АТФ, прежде чем он сможет катализировать фосфорилирование белка . В неактивной конформации F595 мотива DFG блокирует гидрофобный карман связывания аденина , в то время как остатки активационной петли образуют гидрофобные взаимодействия с P-петлей, не давая АТФ получить доступ к своему сайту связывания. Когда активационная петля фосфорилируется, отрицательный заряд фосфата нестабилен в гидрофобной среде P-петли. В результате активационная петля меняет конформацию , растягиваясь через C-долю домена киназы . В этом процессе он образует стабилизирующие взаимодействия β-слоя с цепью β6. Между тем, фосфорилированный остаток приближается к K507, образуя стабилизирующий солевой мостик , чтобы зафиксировать активационную петлю на месте. Мотив DFG изменяет конформацию с активационной петлей, заставляя F595 перемещаться из сайта связывания аденинового нуклеотида в гидрофобный карман, ограниченный спиралями αC и αE . Вместе, DFG и движение активационной петли при фосфорилировании открывают сайт связывания АТФ . Поскольку все другие домены, связывающие субстрат и каталитические домены, уже находятся на месте, фосфорилирование только активационной петли активирует домен киназы B-Raf посредством цепной реакции, которая по сути снимает крышку с иным образом подготовленного активного сайта. [18]
Для эффективного катализа фосфорилирования белка посредством бимолекулярного замещения остатков серина и треонина с АДФ в качестве уходящей группы , B-Raf должен сначала связать АТФ, а затем стабилизировать переходное состояние , поскольку переносится γ-фосфат АТФ. [17]
B-Raf связывает АТФ, закрепляя адениновый нуклеотид в неполярном кармане (желтый, рисунок 1) и ориентируя молекулу посредством водородных связей и электростатических взаимодействий с фосфатными группами. В дополнение к связыванию фосфата с P-петлей и мотивом DFG, описанным выше, K483 и E501 играют ключевые роли в стабилизации непереносимых фосфатных групп. Положительный заряд первичного амина K483 позволяет ему стабилизировать отрицательный заряд на α- и β-фосфатных группах АТФ при связывании АТФ. Когда АТФ отсутствует, отрицательный заряд карбоксильной группы E501 уравновешивает этот заряд. [17] [18]
После связывания АТФ с доменом киназы B-Raf, D576 каталитической петли активирует гидроксильную группу субстрата, увеличивая ее нуклеофильность для кинетического управления реакцией фосфорилирования, в то время как другие остатки каталитической петли стабилизируют переходное состояние (рисунок 2). N581 хелатирует двухвалентный катион магния, связанный с АТФ, чтобы помочь сориентировать молекулу для оптимального замещения. K578 нейтрализует отрицательный заряд на γ-фосфатной группе АТФ, так что активированный остаток субстрата ser/thr не будет испытывать такого сильного отталкивания электронов при атаке фосфата. После переноса фосфатной группы высвобождаются АДФ и новый фосфопротеин. [17]
Поскольку конститутивно активные мутанты B-Raf обычно вызывают рак (см. Клиническое значение), чрезмерно сигнализируя клеткам о росте, были разработаны ингибиторы B-Raf как для неактивных, так и для активных конформаций домена киназы в качестве кандидатов на терапию рака. [18] [19] [20]
BAY43-9006 ( Sorafenib , Nexavar) — это ингибитор B-Raf и C-Raf мутанта V600E , одобренный FDA для лечения первичного рака печени и почек . Bay43-9006 отключает домен киназы B-Raf , блокируя фермент в его неактивной форме. Ингибитор достигает этого, блокируя карман связывания АТФ через высокое сродство к домену киназы. Затем он связывает ключевую петлю активации и остатки мотива DFG, чтобы остановить движение петли активации и мотива DFG к активной конформации. Наконец, трифторметилфенильный фрагмент стерически блокирует мотив DFG и активационный участок активной конформации петли активации, делая невозможным для домена киназы изменить конформацию, чтобы стать активным. [18]
Дистальное пиридильное кольцо BAY43-9006 закрепляется в гидрофобном нуклеотидсвязывающем кармане N-доли киназы, взаимодействуя с W531, F583 и F595. Гидрофобные взаимодействия с каталитической петлей F583 и мотивом DFG F595 стабилизируют неактивную конформацию этих структур, снижая вероятность активации фермента. Дальнейшее гидрофобное взаимодействие K483, L514 и T529 с центральным фенильным кольцом увеличивает сродство домена киназы к ингибитору. Гидрофобное взаимодействие F595 с центральным кольцом также дополнительно снижает энергетическую выгодность переключения конформации DFG. Наконец, полярные взаимодействия BAY43-9006 с доменом киназы продолжают эту тенденцию увеличения сродства фермента к ингибитору и стабилизации остатков DFG в неактивной конформации. E501 и C532 связывают водородом мочевинные и пиридильные группы ингибитора соответственно, в то время как карбонил мочевины принимает водородную связь от азота амидной цепи D594, чтобы зафиксировать мотив DFG на месте. [18]
Трифторметилфенильный фрагмент закрепляет термодинамическую выгодность неактивной конформации, когда домен киназы связан с BAY43-9006, стерически блокируя гидрофобный карман между спиралями αC и αE, который мотив DFG и активационная петля будут занимать при перемещении в их положения в активной конформации белка. [18]
PLX4032 ( Вемурафениб ) — это ингибитор B-Raf мутанта V600 , одобренный FDA для лечения меланомы поздней стадии . [13] В отличие от BAY43-9006 , который ингибирует неактивную форму домена киназы, Вемурафениб ингибирует активную форму «DFG-in» киназы, [19] [20] прочно закрепляясь в сайте связывания АТФ. Ингибируя только активную форму киназы, Вемурафениб селективно ингибирует пролиферацию клеток с нерегулируемым B-Raf, обычно тех, которые вызывают рак .
Поскольку Вемурафениб отличается от своего предшественника, PLX4720, только фенильным кольцом, добавленным по фармакокинетическим причинам, [20] способ действия PLX4720 эквивалентен способу действия Вемурафениба. PLX4720 имеет хорошее сродство к сайту связывания АТФ частично потому, что его якорная область, 7-азаиндольный бициклический , отличается от природного аденина, который занимает сайт, только в двух местах, где атомы азота были заменены углеродом. Это позволяет сохранить сильные межмолекулярные взаимодействия, такие как водородная связь N7 с C532 и водородная связь N1 с Q530. Превосходное соответствие гидрофобному карману связывания АТФ (C532, W531, T529, L514, A481) также увеличивает сродство связывания. Связывание водорода кетонного линкера с водой и дифторфенилом во втором гидрофобном кармане (A481, V482, K483, V471, I527, T529, L514 и F583) способствуют исключительно высокому сродству связывания в целом. Избирательное связывание с активным Raf осуществляется концевой пропильной группой, которая связывается с селективным для Raf карманом, созданным сдвигом спирали αC. Избирательность для активной конформации киназы дополнительно увеличивается за счет чувствительной к pH депротонированной сульфонамидной группы, которая стабилизируется водородной связью с пептидом NH основной цепи D594 в активном состоянии. В неактивном состоянии сульфонамидная группа ингибитора взаимодействует с карбонилом основной цепи этого остатка, создавая отталкивание. Таким образом, вемурафениб связывается преимущественно с активным состоянием домена киназы B-Raf. [19] [20]
Мутации в гене BRAF могут вызывать заболевания двумя способами. Во-первых, мутации могут передаваться по наследству и вызывать врожденные дефекты. Во-вторых, мутации могут появляться в более позднем возрасте и вызывать рак, как онкоген .
Наследственные мутации в этом гене вызывают кардиофациокожный синдром — заболевание, характеризующееся пороками сердца, умственной отсталостью и характерным внешним видом. [25]
Мутации в этом гене были обнаружены при раке, включая неходжкинскую лимфому , колоректальный рак , злокачественную меланому , папиллярный рак щитовидной железы , немелкоклеточный рак легкого , аденокарциному легкого , опухоли мозга , включая глиобластому и плеоморфную ксантоастроцитому, а также воспалительные заболевания, такие как болезнь Эрдгейма-Честера . [10]
Мутация V600E гена BRAF была связана с волосатоклеточным лейкозом в многочисленных исследованиях и была предложена для использования при скрининге синдрома Линча , чтобы уменьшить количество пациентов, проходящих ненужное секвенирование MLH1 . [26] [27]
Было выявлено более 30 мутаций гена BRAF , связанных с раком человека. Частота мутаций BRAF широко варьируется в раковых заболеваниях человека, от более чем 80% в меланомах и невусах , до всего лишь 0–18% в других опухолях , таких как 1–3% в раке легких и 5% в колоректальном раке . [28] В 90% случаев тимин заменяется аденином в нуклеотиде 1799. Это приводит к замене валина (V) на глутамат (E) в кодоне 600 (теперь называемом V600E ) в сегменте активации, который был обнаружен в раковых заболеваниях человека. [29] Эта мутация широко наблюдалась при папиллярной карциноме щитовидной железы , колоректальном раке, меланоме и немелкоклеточном раке легких . [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] Мутация BRAF-V600E присутствует у 57% пациентов с гистиоцитозом клеток Лангерганса. [37] Мутация V600E является вероятной драйверной мутацией в 100% случаев волосатоклеточного лейкоза . [38] Высокая частота мутаций BRAF V600E была обнаружена в амелобластоме , доброкачественном, но локально инфильтративном одонтогенном новообразовании. [39] Мутация V600E также может быть связана как мутация с одним драйвером (генетический «дымящийся пистолет») с некоторыми случаями развития папиллярной краниофарингиомы . [40]
Другие обнаруженные мутации: R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, G469R, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V599D, V599E, V599K, V599R, V600K, A727V и т. д. Большинство этих мутаций сосредоточено в двух областях: богатой глицином P-петле N-доли, а также сегменте активации и фланкирующих областях. [18] Эти мутации изменяют активационный сегмент из неактивного состояния в активное, например, в предыдущей цитируемой статье сообщалось, что алифатическая боковая цепь Val599 взаимодействует с фенильным кольцом Phe467 в петле P. Замена гидрофобной боковой цепи Val среднего размера на более крупный и заряженный остаток, как обнаружено в раке человека (Glu, Asp, Lys или Arg), как ожидается, дестабилизирует взаимодействия, которые поддерживают мотив DFG в неактивной конформации, поэтому переключение активационного сегмента в активное положение. В зависимости от типа мутации активность киназы по отношению к MEK также может различаться. Большинство мутантов стимулируют повышенную активность киназы B-Raf по отношению к MEK. Однако несколько мутантов действуют через другой механизм, потому что, хотя их активность по отношению к MEK снижена, они принимают конформацию, которая активирует C-RAF дикого типа, который затем подает сигнал ERK .
Как упоминалось выше, некоторые фармацевтические фирмы разрабатывают специфические ингибиторы мутировавшего белка B-raf для противоракового применения, поскольку BRAF является хорошо изученной, высокоэффективной мишенью. [19] [42] Вемурафениб (RG7204 или PLX4032) был лицензирован Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США под названием Зелбораф для лечения метастатической меланомы в августе 2011 года на основании клинических данных фазы III. Было отмечено улучшение выживаемости, а также уровень ответа на лечение 53% по сравнению с 7–12% при использовании бывшего лучшего химиотерапевтического лечения дакарбазина . [43] В клинических испытаниях B-Raf увеличил шансы на выживание у пациентов с метастатической меланомой. Несмотря на высокую эффективность препарата, 20% опухолей по-прежнему развивают резистентность к лечению. У мышей 20% опухолей становятся резистентными через 56 дней. [44] Хотя механизмы этой резистентности все еще оспариваются, некоторые гипотезы включают сверхэкспрессию B-Raf для компенсации высоких концентраций вемурафениба [44] и повышение регуляции сигналов роста. [45]
Более общие ингибиторы B-Raf включают GDC-0879, PLX-4720, сорафениб , дабрафениб и энкорафениб .
Белварафениб классифицируется как ингибитор panRAF. Ингибитор panRAF блокирует каталитическую функцию обоих белков в димере. [46]
Было показано, что BRAF (ген) взаимодействует с:
В статье использованы материалы из Словаря терминов, связанных с раком, Национального института рака США .В данной статье использован текст из Национальной медицинской библиотеки США , являющийся общественным достоянием .