Аллергические симптомы вызваны начальным системным высвобождением гистамина активированными базофилами и тучными клетками , что может привести к шоку с отеком гортани , обструкцией нижних дыхательных путей и гипотензией . Вот почему базофилы считаются вместе с тучными клетками ключевыми клетками при аллергических заболеваниях.
Иммуноглобулин E ( IgE ) — это класс антител (или «изотип» иммуноглобулина), который был обнаружен только у млекопитающих. Он играет важную роль в аллергии и особенно связан с гиперчувствительностью типа 1. Существуют рецепторы (FcεR) для константной области IgE, области Fc , на нескольких типах клеток, включая тучные клетки и базофилы. Базофилы содержат много гранул внутри клетки, которые заполнены различными активными веществами, вызывающими аллергическую реакцию при дегрануляции. Клетки активируются и начинают дегрануляцию, когда антитело IgE, связанное с аллергеном, который может связываться со специфической вариабельной областью IgE, областью Fab , связывается с рецептором Fc
В большинстве случаев для выявления аллергии используется положительный кожный тест, но активация базофильных гранулоцитов с помощью анти-IgE, экспрессия антигена CD63 на поверхности клетки (плазматической мембране) позволяет идентифицировать аллерген, ответственный за реакцию гиперчувствительности, без проведения обычного скарификационного теста . Для этого эксперимента требуется лишь небольшое количество крови, что делает его удобным в использовании, поскольку его можно проводить параллельно с обычным анализом крови. Его можно использовать для различных аллергий (например, пчелиный яд , лекарства , контрастные вещества [1] ).
Дегранулированные клетки обнажают молекулы CD63 [2] на своей внешней клеточной мембране, поэтому гранулы , которые содержат молекулы CD63 на своей внутренней поверхности, слились с клеточной мембраной. Внутренняя клеточная поверхность гранул становится внешней клеточной поверхностью базофила/тучной клетки во время процесса дегрануляции.
Поскольку проточная цитометрия является ценным инструментом для анализа большого количества клеток и для идентификации клеточных популяций, даже при низких концентрациях можно определить процент базофилов, активированных после стимуляции in vitro аллергенами и экспрессирующих маркер CD63. Маркер CD63 представляет собой антиген, меченый флуоресцеинизотиоцианатом , который может связываться с белком CD63 и используется для сортировки клеток с помощью FACS (Fluorescence activated cell sorting/sorter). Этот меченый FITC антиген излучает свет с длиной волны 530 нм. Поскольку интенсивность испускаемой флуоресценции пропорциональна сайтам связывания каждой отдельной клетки, интенсивность будет увеличиваться в соответствии с количеством конъюгированных с FITC антител, связанных с экспрессирующими CD63 клетками.
Пробирка готовится с буфером стимуляции базофилов (BSB), включающим интерлейкин 3 и аллерген, который должен быть протестирован. Добавляется образец крови, и пробирка инкубируется при температуре 37 °C в течение нескольких минут, чтобы убедиться, что аллергены могут связаться с IgE. При добавлении ЭДТА в пробирку процесс дегрануляции немедленно останавливается. После дегрануляции в пробирку добавляется маркер CD63 (меченые антитела). Несколько минут при комнатной температуре дают маркеру время для связывания с белками CD63 на клеточной мембране базофила. Выполняется этап лизиса для лизирования эритроцитов. Поскольку они намного превосходят лейкоциты, их необходимо удалить для проведения анализа базофилов FACS.