stringtranslate.com

вмешательство CRISPR

Транскрипционная репрессия посредством стерических помех

Интерференция CRISPR ( CRISPRi ) — это метод генетического возмущения, позволяющий подавлять экспрессию генов в прокариотических и эукариотических клетках в зависимости от последовательности. [1] Впервые он был разработан Стэнли Ци и его коллегами в лабораториях Венделла Лима , Адама Аркина, Джонатана Вайсмана и Дженнифер Дудны . [2] Активация экспрессии генов в зависимости от последовательности относится к активации CRISPR (CRISPRa) .

Основанный на генетической иммунной системе бактерий - пути CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами) [3] , метод обеспечивает дополнительный подход к РНК-интерференции . Однако разница между CRISPRi и РНК-интерференцией заключается в том, что CRISPRi регулирует экспрессию генов в первую очередь на уровне транскрипции, тогда как РНК-интерференция контролирует гены на уровне мРНК.

Фон

Многие бактерии и большинство архей обладают адаптивной иммунной системой, которая включает гены CRISPR РНК (crRNA) и CRISPR-ассоциированные (cas) гены.

Метод интерференции CRISPR (CRISPRi) был впервые описан Леем С. Ци и исследователями из Калифорнийского университета в Сан-Франциско в начале 2013 года. [2] Технология использует каталитически мертвый белок Cas9 (обычно обозначаемый как dCas9), который не обладает эндонуклеазной активностью, для регуляции генов в РНК-направленной манере. Специфичность нацеливания определяется комплементарным спариванием оснований одиночной направляющей РНК (sgRNA) с геномным локусом. sgRNA — это химерная некодирующая РНК, которую можно разделить на три области: последовательность спаривания оснований из 20 нуклеотидов, шпилька, связывающая dCas9, из 42 нуклеотидов, и терминатор из 40 нуклеотидов (бактерии, [4] [5] [6] дрожжи, [7] плодовые мушки, [8] данио-рерио, [9] мыши [10] ).

При проектировании синтетической sgRNA модифицируется только последовательность спаривания оснований из 20 нт. Также необходимо учитывать вторичные переменные: нецелевые эффекты (для которых требуется простой запуск BLAST последовательности спаривания оснований), поддержание структуры шпильки, связывающей dCas9, и обеспечение отсутствия сайтов рестрикции в модифицированной sgRNA, поскольку это может представлять проблему на последующих этапах клонирования. Благодаря простоте дизайна sgRNA эта технология поддается масштабированию по всему геному. [11] CRISPRi полагается на генерацию каталитически неактивного Cas9. Это достигается путем введения точечных мутаций в два каталитических остатка (D10A и H840A) гена, кодирующего Cas9. [12] При этом dCas9 не может расщеплять dsDNA, но сохраняет способность нацеливаться на ДНК. Вместе sgRNA и dCas9 составляют минимальную систему для ген-специфической регуляции. [2]

Регуляция транскрипции

Репрессии

CRISPRi может стерически подавлять транскрипцию, блокируя либо инициацию транскрипции, либо удлинение. Это достигается путем проектирования sgRNA, комплементарной промотору или экзонным последовательностям . Уровень транскрипционной репрессии с целью внутри кодирующей последовательности является специфичным для цепи. В зависимости от природы эффектора CRISPR, либо матричная, либо нематричная цепь приводит к более сильной репрессии. [13] Для dCas9 (на основе системы CRISPR типа 2) репрессия сильнее, когда направляющая РНК комплементарна нематричной цепи. Было высказано предположение, что это связано с активностью геликазы, которая раскручивает гетеродуплекс РНК:ДНК перед РНК-полимеразой II , когда sgRNA комплементарна матричной цепи. В отличие от блока удлинения транскрипции, подавление не зависит от целевой цепи ДНК при нацеливании на сайт начала транскрипции. У прокариот это стерическое ингибирование может подавлять транскрипцию целевого гена почти на 99,9%; у архей было достигнуто более 90% репрессии; [14] в клетках человека наблюдалось до 90% репрессии. [2] У бактерий можно насытить мишень достаточно высоким уровнем комплекса dCas9. В этом случае сила репрессии зависит только от вероятности того, что dCas9 будет выброшен при столкновении с РНК-полимеразой, которая определяется направляющей последовательностью. [15] Более высокие температуры также связаны с более высокой вероятностью выброса, следовательно, более слабой репрессией. [15] У эукариот CRISPRi также может подавлять транскрипцию через эффекторный домен. Слияние репрессорного домена с dCas9 позволяет дополнительно подавлять транскрипцию, вызывая гетерохроматинизацию. Например, хорошо изученный домен Krüppel associated box (KRAB) может быть слит с dCas9 для подавления транскрипции целевого гена до 99% в клетках человека. [16]

Улучшения эффективности

В то время как редактирование генома каталитически активной нуклеазой Cas9 может сопровождаться необратимыми нецелевыми геномными изменениями, CRISPRi является высокоспецифичным с минимальными нецелевыми обратимыми эффектами для двух различных последовательностей sgRNA. [16] Тем не менее, было разработано несколько методов для повышения эффективности транскрипционной модуляции. Идентификация сайта начала транскрипции целевого гена и учет предпочтений sgRNA повышают эффективность, как и наличие доступного хроматина в целевом сайте. [17]

Другие методы

Наряду с другими упомянутыми улучшениями, такие факторы, как расстояние от начала транскрипции и локальное состояние хроматина, могут быть критическими параметрами при определении эффективности активации/репрессии. Оптимизация экспрессии dCas9 и sgRNA, стабильности, ядерной локализации и взаимодействия, вероятно, позволит дополнительно улучшить эффективность CRISPRi в клетках млекопитающих. [2]

Приложения

Генный нокдаун

Было показано, что значительная часть генома (как репортерные, так и эндогенные гены) у эукариот может быть направлена ​​с помощью лентивирусных конструкций для экспрессии dCas9 и sgRNA, с эффективностью, сопоставимой с существующими методами, такими как РНК-интерференция и белки TALE. [16] В тандеме или как отдельная система CRISPRi может использоваться для достижения тех же целей , что и РНК-интерференция.

Для бактерий подавление генов с помощью CRISPRi было полностью реализовано и охарактеризовано (анализ вне целевого объекта, репрессия утечки) как для грамотрицательных E. coli [4] [6] , так и для грамположительных B. subtilis [5] .

Не только в бактериях, но и в археях (например, M. acetivorans ) CRISPRi-Cas9 был успешно использован для подавления нескольких генов/оперонов, связанных с фиксацией азота. [14]

Рабочий процесс построения CRISPRi

Аллельные серии

Дифференциальная экспрессия генов может быть достигнута путем изменения эффективности спаривания оснований sgRNA с целевыми локусами. [11] Теоретически, модуляция этой эффективности может быть использована для создания аллельного ряда для любого заданного гена, по сути, создавая коллекцию гипо- и гиперморфов. Эти мощные коллекции могут быть использованы для проверки любого генетического исследования. Для гипоморфов это позволяет постепенно снижать функцию гена в отличие от бинарной природы нокаутов генов и непредсказуемости нокдаунов. Для гиперморфов это контрастирует с обычным методом клонирования интересующего гена под промоторами с переменной силой.

Визуализация локусов генома

Слияние флуоресцентного белка с dCas9 позволяет визуализировать геномные локусы в живых клетках человека. [18] По сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) этот метод уникальным образом позволяет динамически отслеживать локусы хромосом. Это использовалось для изучения архитектуры хроматина и динамики организации ядра в лабораторных клеточных линиях, включая клетки HeLa.

Стволовые клетки

Активация факторов Яманаки с помощью CRISPRa использовалась для индукции плюрипотентности в клетках человека и мыши, что является альтернативным методом технологии iPS. [19] [20] Кроме того, крупномасштабные активационные скрининги могут использоваться для идентификации белков, которые способствуют индуцированной плюрипотентности или, наоборот, способствуют дифференциации в определенную клеточную линию. [21]

Генетический скрининг

Возможность повышать экспрессию генов с помощью dCas9-SunTag с одной sgRNA также открывает дверь для крупномасштабных генетических скринингов, таких как Perturb-seq , для выявления фенотипов, которые являются результатом повышенной или пониженной экспрессии генов, что будет особенно важно для понимания эффектов регуляции генов при раке. [22] Кроме того, было показано, что системы CRISPRi могут переноситься посредством механизмов горизонтального переноса генов , таких как бактериальная конъюгация и специфическая репрессия репортерных генов в клетках-реципиентах. CRISPRi может служить инструментом для генетического скрининга и потенциального контроля популяции бактерий. [23]

Преимущества и ограничения

Преимущества

  1. CRISPRi может подавлять целевой интересующий ген до 99,9% репрессии. [11] Силу репрессии также можно настраивать, изменяя степень комплементарности между направляющей РНК и мишенью. В отличие от индуцируемых промоторов, частичная репрессия CRISPRi не добавляет транскрипционный шум к экспрессии мишени. [15] Поскольку уровень репрессии закодирован в последовательности ДНК, различные уровни экспрессии могут быть выращены в конкуренции и идентифицированы путем секвенирования. [24]
  2. Поскольку CRISPRi основан на парном строении оснований Уотсона-Крика sgRNA-ДНК и мотиве NGG PAM, выбор целевых участков в геноме является простым и гибким. Были разработаны тщательно определенные протоколы. [11]
  3. Несколько sgRNA могут использоваться не только для одновременного контроля нескольких различных генов (мультиплексный CRISPRi), но и для повышения эффективности регулирования одного и того же целевого гена. Популярная стратегия одновременной экспрессии многих sgRNA заключается в размещении sgRNA в одной конструкции с несколькими промоторами или элементами обработки. Например, массивы сверхдлинных sgRNA (ELSA) используют неповторяющиеся части, чтобы обеспечить прямой синтез массивов 12-sgRNA от поставщика синтеза генов, могут быть напрямую интегрированы в геном E. coli без возникновения гомологичной рекомбинации и могут одновременно воздействовать на множество генов для достижения сложных фенотипов. [25]
  4. Хотя эти две системы могут быть взаимодополняющими, CRISPRi обеспечивает преимущества перед РНК-интерференцией. Как экзогенная система, CRISPRi не конкурирует с эндогенными механизмами, такими как экспрессия или функция микроРНК. Кроме того, поскольку CRISPRi действует на уровне ДНК, можно нацеливаться на такие транскрипты, как некодирующие РНК, микроРНК, антисмысловые транскрипты, ядерно-локализованные РНК и транскрипты полимеразы III. Наконец, CRISPRi обладает гораздо большим целевым пространством последовательностей; промоторы и, в теории, интроны также могут быть нацеливаемы. [16]
  5. В E. coli создание штамма с отключенным геном происходит чрезвычайно быстро и требует только одноэтапной олиго- рекомбинации . [6]

Ограничения

  1. Требование последовательности протоспейсерного смежного мотива (PAM) ограничивает количество потенциальных целевых последовательностей. Cas9 и его гомологи могут использовать различные последовательности PAM, и поэтому теоретически могут быть использованы для расширения количества потенциальных целевых последовательностей. [11]
  2. Специфичность последовательности к целевым локусам составляет всего 14 нт (12 нт sgRNA и 2 нт PAM), что может повторяться около 11 раз в геноме человека. [11] Репрессия обратно коррелирует с расстоянием целевого сайта от сайта начала транскрипции. Геномные вычислительные прогнозы или выбор гомологов Cas9 с более длинным PAM могут снизить неспецифическое нацеливание.
  3. Эндогенные состояния и модификации хроматина могут препятствовать специфическому для последовательности связыванию комплекса dCas9-sgRNA. [11] Уровень транскрипционной репрессии в клетках млекопитающих варьируется между генами. Необходимо проделать большую работу, чтобы понять роль локальной конформации ДНК и хроматина в отношении связывания и регуляторной эффективности.
  4. CRISPRi может влиять на гены, которые находятся в непосредственной близости от целевого гена. Это особенно важно при нацеливании на гены, которые либо перекрывают другие гены (смысловое или антисмысловое перекрытие), либо управляются двунаправленным промотором. [26]
  5. Токсичность, специфичная для последовательностей, была зарегистрирована у эукариот, при этом некоторые последовательности в проксимальном районе PAM вызывали большую нагрузку на приспособленность. [27] Это явление, называемое «эффектом плохого семени», до сих пор не объяснено, но его можно уменьшить, оптимизировав уровень экспрессии dCas9. [28]

Ссылки

  1. ^ Йенсен Т.И., Миккельсен Н.С., Гао З., Фосселтедер Дж., Пабст Г., Аксельгаард Э. и др. (ноябрь 2021 г.). «Направленная регуляция транскрипции в первичных клетках с использованием CRISPRa и CRISPRi». Геномные исследования . 31 (11): 21:20–21:30. дои : 10.1101/гр.275607.121. ПМЦ  8559706 . ПМИД  34407984.
  2. ^ abcde Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA (февраль 2013 г.). «Повторное использование CRISPR в качестве платформы с РНК-управлением для последовательно-специфического контроля экспрессии генов». Cell . 152 (5): 1173–1183. doi :10.1016/j.cell.2013.02.022. PMC 3664290 . PMID  23452860. 
  3. ^ Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S и др. (март 2007 г.). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Science . 315 (5819): 1709–1712. Bibcode :2007Sci...315.1709B. doi :10.1126/science.1138140. hdl : 20.500.11794/38902 . PMID  17379808. S2CID  3888761.
  4. ^ ab Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA (март 2013 г.). «РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas». Nature Biotechnology . 31 (3): 233–239. doi :10.1038/nbt.2508. PMC 3748948 . PMID  23360965. 
  5. ^ ab Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S и др. (июнь 2016 г.). «Комплексный функциональный анализ основных генов бактерий на основе CRISPR». Cell . 165 (6): 1493–1506. doi :10.1016/j.cell.2016.05.003. PMC 4894308 . PMID  27238023. 
  6. ^ abc Li XT, Jun Y, Erickstad MJ, Brown SD, Parks A, Court DL, Jun S (декабрь 2016 г.). "tCRISPRi: настраиваемый и обратимый одношаговый контроль экспрессии генов". Scientific Reports . 6 : 39076. Bibcode :2016NatSR...639076L. doi :10.1038/srep39076. PMC 5171832 . PMID  27996021. 
  7. ^ DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (апрель 2013 г.). «Геномная инженерия в Saccharomyces cerevisiae с использованием систем CRISPR-Cas». Nucleic Acids Research . 41 (7): 4336–4343. doi :10.1093/nar/gkt135. PMC 3627607. PMID  23460208. 
  8. ^ Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM и др. (август 2013 г.). «Геномная инженерия Drosophila с помощью нуклеазы Cas9 под управлением CRISPR RNA». Genetics . 194 (4): 1029–1035. doi :10.1534/genetics.113.152710. PMC 3730909 . PMID  23709638. 
  9. ^ Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD и др. (март 2013 г.). «Эффективное редактирование генома у данио-рерио с использованием системы CRISPR-Cas». Nature Biotechnology . 31 (3): 227–229. doi :10.1038/nbt.2501. PMC 3686313 . PMID  23360964. 
  10. ^ Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (май 2013 г.). «Одношаговое создание мышей, несущих мутации во многих генах, с помощью генной инженерии с использованием CRISPR/Cas». Cell . 153 (4): 910–918. doi :10.1016/j.cell.2013.04.025. PMC 3969854 . PMID  23643243. 
  11. ^ abcdefg Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (ноябрь 2013 г.). "CRISPR-интерференция (CRISPRi) для последовательно-специфического контроля экспрессии генов". Nature Protocols . 8 (11): 2180–2196. doi :10.1038/nprot.2013.132. PMC 3922765 . PMID  24136345. 
  12. ^ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (август 2012 г.). «Программируемая двухРНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете». Science . 337 (6096): 816–821. Bibcode :2012Sci...337..816J. doi :10.1126/science.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  13. ^ Vigouroux A, Bikard D (май 2020 г.). «Инструменты CRISPR для контроля экспрессии генов у бактерий». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 84 (2). doi :10.1128/MMBR.00077-19. PMC 7117552. PMID  32238445. 
  14. ^ ab Dhamad AE, Lessner DJ (октябрь 2020 г.). Atomi H (ред.). "Система CRISPRi-dCas9 для архей и ее использование для изучения функции генов во время фиксации азота Methanosarcina acetivorans". Прикладная и экологическая микробиология . 86 (21): e01402–20. Bibcode : 2020ApEnM..86E1402D. doi : 10.1128/AEM.01402-20. PMC 7580536. PMID 32826220  . 
  15. ^ abc Vigouroux A, Oldewurtel E, Cui L, Bikard D, van Teeffelen S (март 2018 г.). «Настройка способности dCas9 блокировать транскрипцию обеспечивает надежный, бесшумный нокдаун бактериальных генов». Molecular Systems Biology . 14 (3): e7899. doi :10.15252/msb.20177899. PMC 5842579 . PMID  29519933. 
  16. ^ abcd Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE и др. (июль 2013 г.). "CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот". Cell . 154 (2): 442–451. doi :10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145 . PMID  23849981. 
  17. ^ Радзишевская А., Шлюева Д., Мюллер И., Хелин К. (октябрь 2016 г.). «Оптимизация положения sgRNA заметно повышает эффективность CRISPR/dCas9-опосредованной транскрипционной репрессии». Nucleic Acids Research . 44 (18): e141. doi :10.1093/nar/gkw583. PMC 5062975. PMID  27353328 . 
  18. ^ Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW и др. (декабрь 2013 г.). «Динамическая визуализация геномных локусов в живых клетках человека с помощью оптимизированной системы CRISPR/Cas». Cell . 155 (7): 1479–1491. doi :10.1016/j.cell.2013.12.001. PMC 3918502 . PMID  24360272. 
  19. ^ Kearns NA, Genga RM, Enuameh MS, Garber M, Wolfe SA, Maehr R (январь 2014 г.). «Cas9-эффектор-опосредованная регуляция транскрипции и дифференцировки в человеческих плюрипотентных стволовых клетках». Development . 141 (1): 219–223. doi :10.1242/dev.103341. PMC 3865759 . PMID  24346702. 
  20. ^ Hu J, Lei Y, Wong WK, Liu S, Lee KC, He X и др. (апрель 2014 г.). «Прямая активация генов Oct4 человека и мыши с использованием сконструированных факторов транскрипции TALE и Cas9». Nucleic Acids Research . 42 (7): 4375–4390. doi :10.1093/nar/gku109. PMC 3985678. PMID 24500196  . 
  21. ^ Takahashi K, Yamanaka S (август 2006 г.). «Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов». Cell . 126 (4): 663–676. doi :10.1016/j.cell.2006.07.024. hdl : 2433/159777 . PMID  16904174. S2CID  1565219.
  22. ^ Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD (октябрь 2014 г.). «Система маркировки белков для усиления сигнала при экспрессии генов и флуоресцентной визуализации». Cell . 159 (3): 635–646. doi :10.1016/j.cell.2014.09.039. PMC 4252608 . PMID  25307933. 
  23. ^ Ji W, Lee D, Wong E, Dadlani P, Dinh D, Huang V и др. (декабрь 2014 г.). «Специфическая репрессия генов системой CRISPRi, передаваемая через бактериальную конъюгацию». ACS Synthetic Biology . 3 (12): 929–931. doi :10.1021/sb500036q. PMC 4277763 . PMID  25409531. 
  24. ^ Hawkins JS, Silvis MR, Koo BM, Peters JM, Jost M, Hearne CC и др. (2019-10-15). «Модулируемая эффективность CRISPRi раскрывает эволюционную консервацию основных взаимосвязей экспрессии генов и приспособленности у бактерий». bioRxiv : 805333. doi : 10.1101/805333 . S2CID  208583386 . Получено 2020-01-16 .
  25. ^ Reis AC, Halper SM, Vezeau GE, Cetnar DP, Hossain A, Clauer PR, Salis HM (ноябрь 2019 г.). «Одновременное подавление нескольких бактериальных генов с использованием неповторяющихся сверхдлинных массивов sgRNA». Nature Biotechnology . 37 (11): 1294–1301. doi :10.1038/s41587-019-0286-9. OSTI  1569832. PMID  31591552. S2CID  203852115.
  26. ^ Goyal A, Myacheva K, Groß M, Klingenberg M, Duran Arqué B, Diederichs S (февраль 2017 г.). «Проблемы применения CRISPR/Cas9 для длинных некодирующих генов РНК». Nucleic Acids Research . 45 (3): e12. doi :10.1093/nar/gkw883. PMC 5388423. PMID  28180319 . 
  27. ↑ Кюи Л., Вигуру А., Руссе Ф., Варет Х., Ханна В., Бикард Д. (май 2018 г.). «Скрининг CRISPRi в E. coli выявляет специфичную для последовательности токсичность dCas9». Природные коммуникации . 9 (1): 1912. Бибкод : 2018NatCo...9.1912C. дои : 10.1038/s41467-018-04209-5. ПМЦ 5954155 . ПМИД  29765036. 
  28. ^ Depardieu F, Bikard D (февраль 2020 г.). «Gene silencing with CRISPRi in bacteria and optimization of dCas9 expression levels» (PDF) . Методы . Методы для характеристики, применения и обучения системам CRISPR-Cas. 172 : 61–75. doi :10.1016/j.ymeth.2019.07.024. PMID  31377338. S2CID  199436713.