Cas9 ( CRISPR-ассоциированный белок 9 , ранее называвшийся Cas5 , Csn1 или Csx12 ) представляет собой белок массой 160 килодальтон , который играет жизненно важную роль в иммунологической защите некоторых бактерий от ДНК-вирусов и плазмид и широко используется в приложениях генной инженерии . Его основная функция — разрезать ДНК и тем самым изменить геном клетки. Метод редактирования генома CRISPR-Cas9 внес значительный вклад в Нобелевскую премию по химии в 2020 году, присужденную Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна . [2]
Говоря более технически, Cas9 представляет собой фермент ДНК- эндонуклеазу , управляемый двойной РНК , связанный с адаптивной иммунной системой с кластерными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами ( CRISPR ) у Streptococcus pyogenes . [3] [4] [5] S. pyogenes использует CRISPR для запоминания, а Cas9 — для последующего опроса и расщепления чужеродной ДНК, например, вторгшейся ДНК бактериофага или плазмидной ДНК. [4] [6] [7] [8] Cas9 выполняет этот опрос, раскручивая чужеродную ДНК и проверяя сайты, комплементарные спейсерной области из 20 нуклеотидов направляющей РНК (гРНК). Если ДНК-субстрат комплементарен направляющей РНК, Cas9 расщепляет вторгшуюся ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (РНКи) у эукариот.
Помимо своей первоначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 широко использовался в качестве инструмента генной инженерии для индукции сайт-направленных двухцепочечных разрывов ДНК. Эти разрывы могут привести к инактивации генов или внедрению гетерологичных генов посредством негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации соответственно во многих лабораторных модельных организмах. Исследования по разработке различных вариантов cas9 стали многообещающим способом преодоления ограничений редактирования генома CRISPR-Cas9 . Некоторые примеры включают никазу Cas9 (Cas9n), вариант, который индуцирует одноцепочечные разрывы (SSB), или варианты, распознающие различные последовательности PAM . [9] Наряду с нуклеазами с цинковыми пальцами и эффекторными белками , подобными активаторам транскрипции (TALEN), Cas9 становится важным инструментом в области редактирования генома.
В последние годы Cas9 приобрел популярность, поскольку он может расщеплять практически любую последовательность, комплементарную направляющей РНК. [4] Поскольку целевая специфичность Cas9 обусловлена комплементарностью направляющей РНК:ДНК, а не модификациями самого белка (как TALEN и цинковые пальцы ), разработка Cas9 для нацеливания на новую ДНК является простой задачей. [10] Версии Cas9, которые связываются, но не расщепляют родственную ДНК, могут использоваться для локализации активатора или репрессоров транскрипции в определенных последовательностях ДНК, чтобы контролировать активацию и репрессию транскрипции. [11] [12] Нативному Cas9 требуется направляющая РНК, состоящая из двух несопоставимых РНК, которые связываются – РНК CRISPR (crRNA) и транс-активирующей crRNA ( tracrRNA ). [3] Нацеливание на Cas9 было упрощено благодаря созданию химерной единой направляющей РНК (хиРНК). Ученые предположили, что генные драйвы на основе Cas9 могут редактировать геномы целых популяций организмов. [13] В 2015 году Cas9 впервые был использован для модификации генома эмбрионов человека. [14]
Чтобы выжить в различных сложных, негостеприимных средах обитания, наполненных бактериофагами , бактерии и археи разработали методы уклонения от хищных вирусов и борьбы с ними . Сюда входит система адаптивного иммунитета CRISPR. На практике системы CRISPR/Cas действуют как самопрограммируемые ферменты рестрикции. Локусы CRISPR состоят из коротких палиндромных повторов, которые встречаются через регулярные промежутки времени и состоят из чередующихся повторов CRISPR и переменных спейсеров CRISPR длиной от 24 до 48 нуклеотидов. Эти локусы CRISPR обычно сопровождаются соседними CRISPR-ассоциированными (cas) генами. В 2005 году тремя отдельными группами было обнаружено, что спейсерные области гомологичны чужеродным элементам ДНК, включая плазмиды и вирусы. Эти отчеты предоставили первые биологические доказательства того, что CRISPR могут функционировать как иммунная система.
Cas9 часто использовался как инструмент редактирования генома. Cas9 использовался в недавних разработках для предотвращения манипулирования вирусами ДНК хозяев. Поскольку CRISPR-Cas9 был разработан на основе бактериальных геномных систем, его можно использовать для воздействия на генетический материал вирусов. Использование фермента Cas9 может стать решением многих вирусных инфекций. Cas9 обладает способностью воздействовать на определенные вирусы, воздействуя на определенные нити вирусной генетической информации. Более конкретно, фермент Cas9 воздействует на определенные участки вирусного генома, что мешает вирусу выполнять свою нормальную функцию. [15] Cas9 также использовался для разрушения вредной цепи ДНК и РНК, вызывающей заболевания и мутировавшие цепи ДНК. Cas9 уже показал многообещающие результаты в преодолении последствий ВИЧ-1. Было показано, что Cas9 подавляет экспрессию длинных концевых повторов ВИЧ-1. При введении в геном ВИЧ-1 Cas9 продемонстрировал способность мутировать нити ВИЧ-1. [16] [17] Cas9 также использовался при лечении гепатита B путем воздействия на концы определенных длинных терминальных повторов в геноме вируса гепатита B. [18] Cas9 использовался для устранения мутаций, вызывающих катаракту у мышей.
Системы CRISPR-Cas делятся на три основных типа (тип I, тип II и тип III) и двенадцать подтипов, которые основаны на их генетическом содержании и структурных различиях. Однако основными определяющими особенностями всех систем CRISPR-Cas являются гены cas и их белки: cas1 и cas2 универсальны для всех типов и подтипов, тогда как cas3 , cas9 и cas10 являются сигнатурными генами для типа I, типа II и типа III. , соответственно.
Адаптация включает распознавание и интеграцию спейсеров между двумя соседними повторами в локусе CRISPR. «Протоспейсер» относится к последовательности вирусного генома, которая соответствует спейсеру. Короткий участок консервативных нуклеотидов существует проксимальнее протоспейсера, который называется мотивом, примыкающим к протоспейсеру (PAM). PAM представляет собой мотив узнавания, который используется для приобретения фрагмента ДНК. [8] При типе II Cas9 распознает PAM во время адаптации, чтобы гарантировать приобретение функциональных спейсеров. [6]
Утрату спейсеров и даже групп из нескольких также наблюдали Aranaz et al. 2004 и Пурсель и др. 2007. Вероятно, это происходит за счет гомологичной рекомбинации материала между повторами. [19]
Экспрессия CRISPR включает транскрипцию первичного транскрипта, называемого РНК CRISPR (пре-crRNA), который транскрибируется из локуса CRISPR с помощью РНК-полимеразы. Специфические эндорибонуклеазы затем расщепляют пре-crRNA на небольшие CRISPR-РНК (crRNA). [20]
Вмешательство затрагивает crRNA в составе мультибелкового комплекса под названием CASCADE, который может распознавать и специфически спаривать основания с областями вставки комплементарной чужеродной ДНК. Затем комплекс crRNA-чужеродная нуклеиновая кислота расщепляется, однако если между спейсером и целевой ДНК имеются несоответствия или имеются мутации в PAM, то расщепление не начнется. В последнем сценарии чужеродная ДНК не подвергается атаке со стороны клетки, поэтому репликация вируса продолжается, и хозяин не становится невосприимчивым к вирусной инфекции. Стадия вмешательства может механистически и временно отличаться от приобретения и экспрессии CRISPR, однако для полноценного функционирования защитной системы все три фазы должны быть функциональными. [21]
Этап 1: интеграция спейсера CRISPR. Протоспейсеры и связанные с протоспейсерами мотивы (показаны красным) приобретаются на «лидерном» конце массива CRISPR в ДНК хозяина. Массив CRISPR состоит из спейсерных последовательностей (показаны в цветных прямоугольниках), окруженных повторами (черные ромбы). Для этого процесса необходимы Cas1 и Cas2 (и Cas9 в типе II [6] ), которые закодированы в локусе cas, обычно расположенном рядом с массивом CRISPR.
Этап 2: экспрессия CRISPR. Пре-крРНК транскрибируется, начиная с лидерной области, РНК-полимеразой хозяина, а затем расщепляется белками Cas на более мелкие crРНК, содержащие один спейсер и частичный повтор (показанный в виде шпильки с цветными спейсерами).
Этап 3: вмешательство CRISPR. crRNA со спейсером, который имеет сильную комплементарность входящей чужеродной ДНК, начинает событие расщепления (изображено ножницами), для которого требуются белки Cas. Расщепление ДНК препятствует репликации вируса и обеспечивает иммунитет хозяину. Стадия интерференции может функционально и временно отличаться от приобретения и экспрессии CRISPR (изображена белой линией, разделяющей клетку).
dCas9 , также называемый Cas9 с дефицитом эндонуклеазы, можно использовать для редактирования экспрессии гена при применении к сайту связывания транскрипции желаемого участка гена. Оптимальная функция dCas9 объясняется его способом действия. Экспрессия генов ингибируется, когда нуклеотиды больше не добавляются к цепи РНК и, следовательно, прекращают удлинение этой цепи, и, как следствие, влияет на процесс транскрипции. Этот процесс происходит, когда dCas9 производится массово, поэтому он способен влиять на большинство генов в любой момент времени через молекулу направляющей РНК, специфичную для последовательности. Поскольку dCas9, по-видимому, снижает экспрессию генов, это действие усиливается еще больше, когда он используется в сочетании с репрессивными доменами-модификаторами хроматина. [22] Белок dCas9 выполняет и другие функции, помимо регуляции экспрессии генов. К белку dCas9 можно добавить промотор, который позволит им работать друг с другом, чтобы эффективно начинать или останавливать транскрипцию в различных последовательностях вдоль цепи ДНК. Эти два белка специфичны в том, где они действуют на ген. Это преобладает у некоторых типов прокариот, когда промотор и dCas9 выравниваются вместе, препятствуя способности удлинения полимера нуклеотидов, объединяющихся с образованием транскрибируемого фрагмента ДНК. Без промотора белок dCas9 не оказывает такого же эффекта сам по себе или с телом гена. [23]
При дальнейшем изучении эффектов репрессии транскрипции H3K27, аминокислотный компонент гистона, становится метилированным в результате взаимодействия dCas9 и пептида под названием FOG1. По сути, это взаимодействие вызывает репрессию гена на C+N-концевом участке аминокислотного комплекса в специфическом месте соединения гена и, как следствие, прекращает транскрипцию. [24]
dCas9 также оказывается эффективным, когда дело доходит до изменения определенных белков, которые могут вызывать заболевания. Когда dCas9 прикрепляется к форме РНК, называемой направляющей РНК, он предотвращает пролиферацию повторяющихся кодонов и последовательностей ДНК, которые могут быть вредными для генома организма. По сути, когда образуется несколько повторяющихся кодонов, это вызывает ответ или привлекает большое количество dCas9 для борьбы с перепроизводством этих кодонов и приводит к остановке транскрипции. dCas9 работает синергически с гРНК и напрямую влияет на ДНК-полимеразу II, вызывая продолжение транскрипции.
Дальнейшее объяснение того, как работает белок dCas9, можно найти в использовании ими растительных геномов путем регуляции производства генов в растениях для увеличения или уменьшения определенных характеристик. Система CRISPR-CAS9 способна как активировать, так и подавлять гены. Белки dCas9 являются компонентом системы CRISPR-CAS9 и могут подавлять определенные области гена растения. Это происходит, когда dCAS9 связывается с репрессорными доменами, а в случае растений действительно происходит дезактивация регуляторного гена, такого как AtCSTF64. [25]
Бактерии также являются еще одним направлением использования белков dCas9. Поскольку эукариоты имеют более крупный состав ДНК и геном; с гораздо меньшими бактериями легко манипулировать. В результате эукариоты используют dCas9 для ингибирования продолжения процесса транскрипции генетического материала РНК-полимеразой. [26]
Cas9 имеет двухдольную архитектуру, в которой направляющая РНК расположена между альфа-спиральной долей (синий) и долей нуклеазы (голубой, оранжевый и серый). Эти две доли соединены одной спиралью мостика. В многодоменной доле нуклеазы расположены два домена нуклеазы: RuvC (серый), который расщепляет нецелевую цепь ДНК, и домен нуклеазы HNH (голубой), который расщепляет целевую цепь ДНК. Домен RuvC кодируется последовательно разрозненными сайтами, которые взаимодействуют в третичной структуре с образованием домена расщепления RuvC (см. рисунок справа).
Ключевой особенностью целевой ДНК является то, что она должна содержать мотив, примыкающий к протоспейсеру (PAM), состоящий из трехнуклеотидной последовательности - NGG. Этот PAM распознается PAM-взаимодействующим доменом (домен PI, оранжевый), расположенным вблизи С-конца Cas9. Cas9 претерпевает отчетливые конформационные изменения между состояниями апо, связанной с направляющей РНК и связанной с направляющей РНК:ДНК.
Cas9 распознает архитектуру «стебель-петля» , присущую локусу CRISPR, которая опосредует созревание рибонуклеопротеинового комплекса crRNA-tracrRNA. [28] Cas9 в комплексе с CRISPR РНК (crRNA) и транс-активирующей crRNA (tracrRNA) дополнительно распознает и разрушает целевую дцДНК. [29] В показанной здесь сокристаллической структуре комплекс crRNA-tracrRNA заменен химерной однопроводниковой РНК (sgRNA, выделена красным), которая, как было доказано, выполняет ту же функцию, что и природный комплекс РНК. [4] Основание sgRNA в паре с целевой оцДНК закрепляется с помощью Cas9 в виде Т-образной архитектуры. Эта кристаллическая структура связанного с ДНК фермента Cas9 демонстрирует отчетливые конформационные изменения в альфа-спиральной доли по отношению к доле нуклеазы, а также расположение домена HNH. Белок состоит из доли узнавания (REC) и доли нуклеазы (NUC). Все регионы, кроме HNH, образуют тесные взаимодействия друг с другом и комплексом огРНК-оцДНК, тогда как домен HNH образует мало контактов с остальной частью белка. В другой конформации комплекса Cas9, наблюдаемой в кристалле, домен HNH не виден. Эти структуры предполагают конформационную гибкость домена HNH.
На сегодняшний день изучены и опубликованы как минимум три кристаллические структуры. Один представляет конформацию Cas9 в состоянии апо [27] и два представляют Cas9 в состоянии, связанном с ДНК. [30] [1]
В комплексе sgRNA-Cas9, исходя из кристаллической структуры, домены REC1, BH и PI имеют важные контакты с основной цепью или основаниями как в повторяющейся, так и в спейсерной области. [1] [30] Были протестированы несколько мутантов Cas9, включая делецию доменов REC1 или REC2 и мутации остатков в BH. Мутанты, родственные REC1 и BH, проявляют более низкую активность или ее отсутствие по сравнению с диким типом, что указывает на то, что эти два домена имеют решающее значение для распознавания sgRNA при повторной последовательности и стабилизации всего комплекса. Хотя взаимодействие между спейсерной последовательностью и Cas9, а также доменом PI и областью повтора требует дальнейшего изучения, сокристалл демонстрирует четкую границу между Cas9 и sgRNA.
Предыдущий анализ последовательностей и биохимические исследования показали, что Cas9 содержит два нуклеазных домена: McrA-подобный нуклеазный домен HNH и RuvC-подобный нуклеазный домен. [31] Эти HNH и RuvC-подобные нуклеазные домены ответственны за расщепление комплементарной/целевой и некомплементарной/нецелевой цепей ДНК соответственно. [4] Несмотря на низкое сходство последовательностей, последовательность, сходная с РНКазой H, имеет складку RuvC (один член семейства РНКазы H), а область HNH складывается, как T4 Endo VII (один член семейства эндонуклеаз HNH). [ нужна цитата ]
S. pyogenes Cas9 дикого типа требует кофакторов магния (Mg 2+ ) для РНК-опосредованного расщепления ДНК; однако было показано, что Cas9 проявляет различные уровни активности в присутствии ионов других двухвалентных металлов. [4] Например, было показано, что Cas9 в присутствии марганца (Mn 2+ ) способен к РНК-независимому расщеплению ДНК. [32] Кинетика расщепления ДНК Cas9 представляет большой интерес для научного сообщества , поскольку эти данные дают представление о тонкостях реакции. Хотя было показано, что расщепление ДНК РНК-связанным Cas9 происходит относительно быстро ( k ≥ 700 с -1 ), высвобождение продуктов расщепления происходит очень медленно ( t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43–43–1) . 91 h), по существу превращая Cas9 в фермент с одним оборотом . [33] Дополнительные исследования кинетики Cas9 показали, что сконструированный Cas9 эффективен в снижении нецелевых эффектов за счет изменения скорости реакции. [34] [35]
Эффективность расщепления Cas9 зависит от множества факторов. Ключевым требованием является наличие действующего PAM в нецелевой цепи, находящейся на 3 нуклеотида ниже сайта расщепления. [36] Каноническая последовательность PAM для S. Pyogenes Cas9 представляет собой NGG, но альтернативные мотивы допускаются с более низкой активностью расщепления. Наиболее эффективными альтернативными мотивами PAM для S. Pyogenes Cas9 дикого типа являются NAG и NGA. [37] [38] Состав последовательности в целевом участке ДНК, комплементарном спейсерной области из 20 нуклеотидов гРНК, также влияет на эффективность расщепления. Наиболее значимыми свойствами нуклеотидного состава, влияющими на эффективность, являются свойства проксимальной области PAM. [39] [40] [38] Изменения свободной энергии нуклеиновых кислот также очень важны для определения активности расщепления. [41] Направляющие РНК, которые связываются с ДНК, образуя дуплекс, который попадает в ограниченный диапазон изменений свободной энергии связывания, исключающий чрезвычайно слабые или стабильные связывания, обычно работают эффективно. [38] Стабильные конформации сворачивания направляющей РНК также могут нарушать расщепление. [42]
Большинство архей и бактерий упорно не позволяют Cas9 редактировать их геном. Это потому, что они могут присоединять к своему геному чужеродную ДНК, которая на них не влияет. Другой способ, которым эти клетки игнорируют Cas9, — это система процесса модификации рестрикции (RM). Когда бактериофаг проникает в клетку бактерии или археи, на него воздействует система RM. Затем система RM разрезает ДНК бактериофага на отдельные части с помощью ферментов рестрикции и использует эндонуклеазы для дальнейшего разрушения нитей ДНК. Это создает проблему для редактирования Cas9, поскольку система RM также нацелена на чужеродные гены, добавленные в процессе Cas9. [43]
Из-за уникальной способности Cas9 связываться практически с любой последовательностью комплемента в любом геноме , исследователи хотели использовать этот фермент для подавления транскрипции различных геномных локусов . Для этого два важнейших каталитических остатка доменов RuvC и HNH могут быть мутированы в аланин , устраняющий всю эндонуклеазную активность Cas9. Полученный белок, названный «мертвым» Cas9 или сокращенно «dCas9», все еще может прочно связываться с дцДНК. Этот каталитически неактивный вариант Cas9 использовался как для механистических исследований вопросительного связывания ДНК Cas9, так и в качестве общего программируемого ДНК-связывающего комплекса РНК-белок.
Взаимодействие dCas9 с целевой дцДНК настолько тесное, что высокомолярный денатурирующий белок мочевины не может полностью диссоциировать комплекс РНК-белок dCas9 от дцДНК-мишени. [44] dCas9 был нацелен с помощью сконструированных одиночных направляющих РНК на сайты инициации транскрипции любых локусов, где dCas9 может конкурировать с РНК-полимеразой на промоторах, останавливая транскрипцию. [45] Кроме того, dCas9 может быть нацелен на кодирующую область локусов, так что ингибирование РНК-полимеразы происходит во время фазы элонгации транскрипции. [45] У эукариот подавление экспрессии генов может быть расширено путем нацеливания dCas9 на последовательности энхансера, где dCas9 может блокировать сборку транскрипционных факторов, что приводит к подавлению экспрессии специфических генов. [12] Более того, направляющие РНК, предоставляемые dCas9, могут быть разработаны так, чтобы включать специфические несоответствия с его комплементарной родственной последовательностью, что будет количественно ослаблять взаимодействие dCas9 с его запрограммированной родственной последовательностью, позволяя исследователю настраивать степень подавления гена, применяемого к гену. представляет интерес. [45] Эта технология в принципе аналогична РНКи , поскольку экспрессия генов модулируется на уровне РНК. Тем не менее, подход dCas9 получил большую популярность, поскольку существует меньше нецелевых эффектов и, в целом, более крупные и воспроизводимые эффекты подавления за счет использования dCas9 по сравнению с скринингами RNAi. [46] Более того, поскольку подход dCas9 к подавлению генов можно контролировать количественно, исследователь теперь может точно контролировать степень, в которой репрессируется интересующий ген, что позволяет ответить на больше вопросов о регуляции генов и стехиометрии генов.
Помимо прямого связывания dCas9 с транскрипционно-чувствительными позициями локусов, dCas9 может быть слит с различными доменами модулирующих белков для выполнения множества функций. Недавно dCas9 был слит с белками ремоделирования хроматина (HDACs/HATs) для реорганизации структуры хроматина вокруг различных локусов. [45] Это важно для воздействия на различные представляющие интерес эукариотические гены, поскольку структуры гетерохроматина препятствуют связыванию Cas9. Более того, поскольку Cas9 может реагировать на гетерохроматин , предполагается, что этот фермент в дальнейшем может быть применен для изучения структуры хроматина различных локусов. [45] Кроме того, dCas9 использовался в полногеномном скрининге репрессии генов. Используя большие библиотеки направляющих РНК, способных воздействовать на тысячи генов, были проведены полногеномные генетические скрининги с использованием dCas9. [47]
Другой метод подавления транскрипции с помощью Cas9 заключается в прямом расщеплении продуктов мРНК каталитически активным ферментом Cas9. [48] Этот подход стал возможным благодаря гибридизации оцДНК с комплементарной последовательностью PAM с оцРНК, что позволяет создать сайт PAM дцДНК-РНК для связывания Cas9. Эта технология дает возможность изолировать эндогенные транскрипты РНК в клетках без необходимости индуцировать химические модификации РНК или методы РНК-маркирования.
В отличие от генов, подавляющих молчание, dCas9 также можно использовать для активации генов при слиянии с факторами, активирующими транскрипцию. [45] Эти факторы включают субъединицы бактериальной РНК-полимеразы II и традиционные факторы транскрипции у эукариот. Недавно были также проведены полногеномные скрининги активации транскрипции с использованием для активации слияний dCas9, названных «CRISPRa». [47]
{{cite book}}
: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )