stringtranslate.com

Cas9

Cas9 ( белок 9, ассоциированный с CRISPR , ранее называвшийся Cas5 , Csn1 или Csx12 ) — это белок массой 160 килодальтон , который играет жизненно важную роль в иммунологической защите некоторых бактерий от ДНК-вирусов и плазмид и широко используется в генной инженерии . Его основная функция — разрезать ДНК и тем самым изменять геном клетки. Метод редактирования генома CRISPR-Cas9 внес значительный вклад в присуждение Нобелевской премии по химии в 2020 году Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна . [2]

Более технически, Cas9 является ферментом ДНК -эндонуклеазой, управляемой РНК , связанным с адаптивной иммунной системой Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ( CRISPR ) в Streptococcus pyogenes . [3] [4] [5] S. pyogenes использует CRISPR для запоминания, а Cas9 — для последующего опроса и расщепления чужеродной ДНК, такой как ДНК вторгающегося бактериофага или плазмидной ДНК. [4] [6] [7] [8] Cas9 выполняет этот опрос, раскручивая чужеродную ДНК и проверяя сайты, комплементарные 20-нуклеотидному спейсерному региону направляющей РНК (гРНК). Если субстрат ДНК комплементарен направляющей РНК, Cas9 расщепляет вторгающуюся ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (РНКи) у эукариот.

Помимо своей первоначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 широко использовался в качестве инструмента генной инженерии для индуцирования сайт-направленных двухцепочечных разрывов в ДНК. Эти разрывы могут привести к инактивации генов или внедрению гетерологичных генов посредством негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации соответственно во многих лабораторных модельных организмах. Исследования по разработке различных вариантов cas9 стали многообещающим способом преодоления ограничений редактирования генома CRISPR-Cas9 . Некоторые примеры включают никазу Cas9 (Cas9n), вариант, который индуцирует одноцепочечные разрывы (SSB) или варианты, распознающие различные последовательности PAM . [9] Наряду с нуклеазами цинковых пальцев и эффекторными белками нуклеазы, подобными активаторам транскрипции (TALEN), Cas9 становится важным инструментом в области редактирования генома.

Cas9 приобрел популярность в последние годы, поскольку он может расщеплять практически любую последовательность, комплементарную направляющей РНК. [4] Поскольку целевая специфичность Cas9 обусловлена ​​комплементарностью направляющей РНК:ДНК, а не модификациями самого белка (такими как TALEN и цинковые пальцы ), разработка Cas9 для нацеливания на новую ДНК проста. [10] Версии Cas9, которые связываются, но не расщепляют родственную ДНК, могут использоваться для обнаружения транскрипционных активаторов или репрессоров в определенных последовательностях ДНК с целью контроля транскрипционной активации и репрессии. [11] [12] Для собственного Cas9 требуется направляющая РНК, состоящая из двух разнородных РНК, которые ассоциируются — CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующей crRNA ( tracrRNA ). [3] Нацеливание Cas9 было упрощено за счет разработки химерной одиночной направляющей РНК (chiRNA). Ученые предположили, что генные драйвы на основе Cas9 могут быть способны редактировать геномы целых популяций организмов. [13] В 2015 году Cas9 впервые был использован для модификации генома человеческих эмбрионов. [14]

CRISPR-опосредованный иммунитет

Чтобы выжить в различных сложных, негостеприимных местах обитания, заполненных бактериофагами , бактерии и археи выработали методы уклонения и отражения хищных вирусов . Сюда входит система адаптивного иммунитета CRISPR. На практике системы CRISPR/Cas действуют как самопрограммируемые рестриктазы. Локусы CRISPR состоят из коротких палиндромных повторов, которые встречаются с регулярными интервалами и состоят из альтернативных повторов CRISPR и переменных спейсеров CRISPR длиной от 24 до 48 нуклеотидов. Эти локусы CRISPR обычно сопровождаются соседними генами, ассоциированными с CRISPR (cas). В 2005 году тремя отдельными группами было обнаружено, что области спейсеров гомологичны чужеродным элементам ДНК, включая плазмиды и вирусы. Эти отчеты предоставили первые биологические доказательства того, что CRISPR могут функционировать как иммунная система.

Cas9 часто использовался как инструмент редактирования генома. Cas9 использовался в последних разработках по предотвращению манипуляций вирусами с ДНК хозяев. Поскольку CRISPR-Cas9 был разработан на основе бактериальных геномных систем, его можно использовать для нацеливания на генетический материал вирусов. Использование фермента Cas9 может быть решением многих вирусных инфекций. Cas9 обладает способностью нацеливаться на определенные вирусы путем нацеливания на определенные нити вирусной генетической информации. Более конкретно, фермент Cas9 нацеливается на определенные участки вирусного генома, которые мешают вирусу выполнять свою нормальную функцию. [15] Cas9 также использовался для разрушения вредной нити ДНК и РНК, вызывающих заболевания и мутировавших нитей ДНК. Cas9 уже показал себя многообещающим в нарушении эффектов ВИЧ-1. Было показано, что Cas9 подавляет экспрессию длинных концевых повторов в ВИЧ-1. При введении в геном ВИЧ-1 Cas9 продемонстрировал способность вызывать мутации нитей ВИЧ-1. [16] [17] Cas9 также использовался при лечении гепатита B путем воздействия на концы определенных длинных концевых повторов в геноме вируса гепатита B. [18] Cas9 использовался для исправления мутаций, вызывающих катаракту у мышей.

Рис. 2: Стадии иммунитета CRISPR

Системы CRISPR-Cas делятся на три основных типа (тип I, тип II и тип III) и двенадцать подтипов, которые основаны на их генетическом содержании и структурных различиях. Однако основными определяющими характеристиками всех систем CRISPR-Cas являются гены cas и их белки: cas1 и cas2 универсальны для всех типов и подтипов, тогда как cas3 , cas9 и cas10 являются сигнатурными генами для типа I, типа II и типа III соответственно.

Стадии защиты CRISPR-Cas

Приспособление

Адаптация включает в себя распознавание и интеграцию спейсеров между двумя соседними повторами в локусе CRISPR. «Протоспейсер» относится к последовательности в вирусном геноме, которая соответствует спейсеру. Короткий участок консервативных нуклеотидов существует проксимальнее протоспейсера, который называется мотивом, смежным с протоспейсером (PAM). PAM — это мотив распознавания, который используется для получения фрагмента ДНК. [8] В типе II Cas9 распознает PAM во время адаптации, чтобы обеспечить получение функциональных спейсеров. [6]

Потеря спейсеров и даже групп из нескольких спейсеров также наблюдалась Араназом и др. 2004 г. и Пурселем и др. 2007 г. Вероятно, это происходит посредством гомологичной рекомбинации материала между повторами. [19]

Обработка/биогенез CRISPR

Экспрессия CRISPR включает транскрипцию первичного транскрипта, называемого CRISPR РНК (pre-crRNA), который транскрибируется из локуса CRISPR РНК-полимеразой. Затем специфические эндорибонуклеазы расщепляют pre-crRNA на малые CRISPR РНК (crRNA). [20]

Помехи/невосприимчивость

Интерференция включает в себя crRNA в составе многобелкового комплекса, называемого CASCADE, который может распознавать и специфически спаривать основания с областями вставки комплементарной чужеродной ДНК. Затем комплекс crRNA-чужеродная нуклеиновая кислота расщепляется, однако, если есть несоответствия между спейсером и целевой ДНК или если есть мутации в PAM, то расщепление не будет инициировано. В последнем случае чужеродная ДНК не подвергается атаке со стороны клетки, таким образом, репликация вируса продолжается, и хозяин не имеет иммунитета к вирусной инфекции. Стадия интерференции может быть механистически и временно отличной от приобретения и экспрессии CRISPR, однако для полной функции в качестве защитной системы все три фазы должны быть функциональными. [21]

Стадия 1: Интеграция спейсера CRISPR. Протоспейсеры и мотивы, связанные с протоспейсерами (показаны красным), приобретаются на конце «лидера» массива CRISPR в ДНК хозяина. Массив CRISPR состоит из последовательностей спейсеров (показаны в цветных квадратах), окруженных повторами (черные ромбы). Для этого процесса требуются Cas1 и Cas2 (и Cas9 в типе II [6] ), которые кодируются в локусе cas, который обычно расположен рядом с массивом CRISPR.

Стадия 2: Экспрессия CRISPR. Pre-crRNA транскрибируется, начиная с лидерной области, РНК-полимеразой хозяина, а затем расщепляется белками Cas на более мелкие crRNA, содержащие один спейсер и частичный повтор (показано в виде шпильковой структуры с цветными спейсерами).

Стадия 3: вмешательство CRISPR. crRNA со спейсером, который имеет сильную комплементарность с входящей чужеродной ДНК, начинает событие расщепления (изображено ножницами), которое требует белков Cas. Расщепление ДНК препятствует репликации вируса и обеспечивает иммунитет хозяину. Стадия вмешательства может быть функционально и временно отличной от приобретения и экспрессии CRISPR (изображено белой линией, разделяющей клетку).

Деактивация транскрипции с использованием dCas9

dCas9 , также называемый эндонуклеазно-дефицитным Cas9, может использоваться для редактирования экспрессии генов при применении к сайту связывания транскрипции желаемого участка гена. Оптимальная функция dCas9 объясняется его способом действия. Экспрессия генов подавляется, когда нуклеотиды больше не добавляются к цепи РНК и, следовательно, не прекращают удлинение этой цепи, и в результате влияет на процесс транскрипции. Этот процесс происходит, когда dCas9 производится массово, поэтому он способен влиять на большинство генов в любой момент времени через молекулу направляющей РНК, специфичную для последовательности. Поскольку dCas9, по-видимому, подавляет экспрессию генов, это действие усиливается еще больше, когда он используется в сочетании с репрессивными доменами модификаторов хроматина. [22] Белок dCas9 имеет и другие функции за пределами регуляции экспрессии генов. Промотор может быть добавлен к белку dCas9, что позволяет им работать друг с другом, чтобы стать эффективными при начале или остановке транскрипции в различных последовательностях вдоль цепи ДНК. Эти два белка специфичны в том, где они действуют на ген. Это распространено в определенных типах прокариот, когда промотор и dCas9 выстраиваются вместе, чтобы препятствовать возможности удлинения полимера нуклеотидов, собирающихся вместе для формирования транскрибируемого фрагмента ДНК. Без промотора белок dCas9 не имеет того же эффекта сам по себе или с телом гена. [23]

При дальнейшем изучении эффектов репрессии транскрипции H3K27, аминокислотный компонент гистона, становится метилированным посредством взаимодействия dCas9 и пептида, называемого FOG1. По сути, это взаимодействие вызывает репрессию гена на концевом участке C + N аминокислотного комплекса в специфическом соединении гена и, как следствие, прекращает транскрипцию. [24]

dCas9 также оказывается эффективным, когда дело доходит до изменения определенных белков, которые могут вызывать заболевания. Когда dCas9 присоединяется к форме РНК, называемой направляющей РНК, он предотвращает распространение повторяющихся кодонов и последовательностей ДНК, которые могут быть вредны для генома организма. По сути, когда производится несколько повторяющихся кодонов, это вызывает ответ или привлекает избыток dCas9 для борьбы с перепроизводством этих кодонов и приводит к остановке транскрипции. dCas9 работает синергически с gRNA и напрямую влияет на ДНК-полимеразу II, не позволяя ей продолжать транскрипцию.

Дальнейшее объяснение того, как работает белок dCas9, можно найти в их использовании растительных геномов путем регуляции производства генов в растениях для увеличения или уменьшения определенных характеристик. Система CRISPR-CAS9 обладает способностью как повышать, так и понижать регуляцию генов. Белки dCas9 являются компонентом системы CRISPR-CAS9, и эти белки могут подавлять определенные области гена растения. Это происходит, когда dCAS9 связывается с доменами репрессора, и в случае растений происходит деактивация регуляторного гена, такого как AtCSTF64. [25]

Бактерии также являются еще одним объектом использования белков dCas9. Поскольку эукариоты имеют более крупный состав ДНК и геном, гораздо более мелкими бактериями легче манипулировать. В результате эукариоты используют dCas9 для ингибирования РНК-полимеразы от продолжения процесса транскрипции генетического материала. [26]

Структурные и биохимические исследования

Кристаллическая структура

Структура Cas9
Кристаллическая структура CRISPR-ассоциированного белка Cas9 на основе PDB 5AXW Нишимасу и др.

Cas9 имеет двухдольчатую архитектуру с направляющей РНК, расположенной между альфа-спиральной долей (синяя) и нуклеазной долей (голубая, оранжевая и серая). Эти две доли соединены одной мостиковой спиралью. В многодоменной нуклеазной доле расположены два нуклеазных домена: RuvC (серый), который расщепляет нецелевую цепь ДНК, и нуклеазный домен HNH (голубой), который расщепляет целевую цепь ДНК. Домен RuvC кодируется последовательно разрозненными сайтами, которые взаимодействуют в третичной структуре, образуя домен расщепления RuvC (см. правый рисунок).

Кристаллическая структура Cas9 в форме Apo. [27] Структурная визуализация была выполнена с использованием программного обеспечения UCSF Chimera.

Ключевой особенностью целевой ДНК является то, что она должна содержать мотив, смежный с протоспейсером (PAM), состоящий из трехнуклеотидной последовательности - NGG. Этот PAM распознается доменом, взаимодействующим с PAM (домен PI, оранжевый), расположенным около C-терминального конца Cas9. Cas9 претерпевает отчетливые конформационные изменения между состояниями апо, направляющей РНК и направляющей РНК:ДНК.

Cas9 распознает архитектуру стебля-петли , присущую локусу CRISPR, что опосредует созревание комплекса рибонуклеопротеина crRNA-tracrRNA . [28] Cas9 в комплексе с CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующей crRNA (tracrRNA) дополнительно распознает и разрушает целевую dsDNA. [29] В показанной здесь структуре сокристалла комплекс crRNA-tracrRNA заменен химерной одинарной направляющей РНК (sgRNA, выделена красным), которая, как было доказано, имеет ту же функцию, что и естественный комплекс РНК. [4] Основание sgRNA, сопряженное с целевой ssDNA, закреплено Cas9 в виде Т-образной архитектуры. Эта кристаллическая структура связанного с ДНК фермента Cas9 выявляет отчетливые конформационные изменения в альфа-спиральной доле по отношению к доле нуклеазы, а также местоположение домена HNH. Белок состоит из распознающей доли (REC) и нуклеазной доли (NUC). Все регионы, за исключением HNH, образуют тесные взаимодействия друг с другом и комплексом sgRNA-ssDNA, в то время как домен HNH образует мало контактов с остальной частью белка. В другой конформации комплекса Cas9, наблюдаемой в кристалле, домен HNH не виден. Эти структуры предполагают конформационную гибкость домена HNH.

На сегодняшний день изучены и опубликованы по крайней мере три кристаллические структуры. Одна представляет собой конформацию Cas9 в апо-состоянии, [27] и две представляют собой Cas9 в связанном с ДНК состоянии. [30] [1]

Взаимодействие с sgRNA

CRISPR/Cas9

В комплексе sgRNA-Cas9, исходя из кристаллической структуры, домены REC1, BH и PI имеют важные контакты с остовом или основаниями как в области повтора, так и в области спейсера. [1] [30] Было протестировано несколько мутантов Cas9, включая делецию доменов REC1 или REC2 и мутации остатков в BH. Мутанты, связанные с REC1 и BH, показывают более низкую или нулевую активность по сравнению с диким типом, что указывает на то, что эти два домена имеют решающее значение для распознавания sgRNA в последовательности повтора и стабилизации всего комплекса. Хотя взаимодействия между последовательностью спейсера и Cas9, а также доменом PI и областью повтора требуют дальнейших исследований, сокристалл демонстрирует четкий интерфейс между Cas9 и sgRNA.

расщепление ДНК

Нуклеаза Cas9 и ее позиция расщепления ДНК

Предыдущий анализ последовательности и биохимические исследования показали, что Cas9 содержит два домена нуклеазы: домен нуклеазы HNH, подобный McrA, и домен нуклеазы RuvC, подобный RuvC. [31] Эти домены нуклеазы HNH и RuvC отвечают за расщепление комплементарных/целевых и некомплементарных/нецелевых цепей ДНК соответственно. [4] Несмотря на низкое сходство последовательностей, последовательность, похожая на РНКазу H, имеет складку RuvC (один из членов семейства РНКазы H), а область HNH складывается как T4 Endo VII (один из членов семейства эндонуклеазы HNH). [ требуется ссылка ]

Для дикого типа S. pyogenes Cas9 требуются кофакторы магния (Mg2 + ) для РНК-опосредованного расщепления ДНК; однако было показано, что Cas9 проявляет различные уровни активности в присутствии других двухвалентных ионов металлов. [4] Например, было показано, что Cas9 в присутствии марганца (Mn2 + ) способен к РНК-независимому расщеплению ДНК. [32] Кинетика расщепления ДНК Cas9 представляла большой интерес для научного сообщества, поскольку эти данные дают представление о тонкостях реакции. В то время как расщепление ДНК РНК-связанным Cas9, как было показано, происходит относительно быстро ( k ≥ 700 с −1 ), высвобождение продуктов расщепления происходит очень медленно ( t1 /2 = ln(2)/ k ≈ 43–91 ч), что по сути делает Cas9 ферментом с одним оборотом . [33] Дополнительные исследования кинетики Cas9 показали, что сконструированный Cas9 эффективен в снижении нецелевых эффектов путем изменения скорости реакции. [34] [35]

Эффективность расщепления Cas9 зависит от множества факторов. Ключевым требованием является наличие действительного PAM в нецелевой цепи 3 нуклеотида ниже по течению от сайта расщепления. [36] Каноническая последовательность PAM для S. Pyogenes Cas9 - NGG, но альтернативные мотивы допускаются с более низкой активностью расщепления. Наиболее эффективными альтернативными мотивами PAM для дикого типа S. Pyogenes Cas9 являются NAG и NGA. [37] [38] Состав последовательности в целевом участке ДНК, комплементарный 20-нуклеотидному спейсерному региону gRNA, также влияет на эффективность расщепления. Наиболее значимые свойства состава нуклеотидов, которые влияют на эффективность, находятся в проксимальном регионе PAM. [39] [40] [38] Изменения свободной энергии нуклеиновых кислот также имеют большое значение для определения активности расщепления. [41] Направляющие РНК, которые связываются с ДНК, образуя дуплекс, который попадает в ограниченный диапазон изменений свободной энергии связывания, что исключает чрезвычайно слабые или стабильные связи, как правило, работают эффективно. [38] Стабильные конформации сворачивания направляющих РНК также могут ухудшать расщепление. [42]

Проблемы, которые бактерии создают для редактирования Cas9

Большинство архей и бактерий упорно отказываются позволять Cas9 редактировать их геном. Это происходит потому, что они могут прикреплять чужеродную ДНК, которая не влияет на них, к своему геному. Другой способ, которым эти клетки игнорируют Cas9, — это процесс системы модификации рестрикции (RM). Когда бактериофаг проникает в клетку бактерии или археи, он становится целью системы RM. Затем система RM разрезает ДНК бактериофага на отдельные части с помощью рестриктаз и использует эндонуклеазы для дальнейшего разрушения нитей ДНК. Это создает проблему для редактирования Cas9, поскольку система RM также нацелена на чужеродные гены, добавленные процессом Cas9. [43]

Применение Cas9 для настройки транскрипции

Вмешательство dCas9 в транскрипцию

Из-за уникальной способности Cas9 связываться практически с любой комплементарной последовательностью в любом геноме , исследователи хотели использовать этот фермент для подавления транскрипции различных геномных локусов . Чтобы добиться этого, два важнейших каталитических остатка домена RuvC и HNH могут быть мутированы в аланин, отменяя всю эндонуклеазную активность Cas9. Полученный белок, названный «мертвым» Cas9 или «dCas9» для краткости, все еще может прочно связываться с dsDNA. Этот каталитически неактивный вариант Cas9 использовался как для механистических исследований ДНК-интерференционного связывания Cas9, так и в качестве общего программируемого ДНК-связывающего комплекса РНК-белок.

Взаимодействие dCas9 с целевой dsDNA настолько тесное, что денатурирующий белок мочевины с высокой молярностью не может полностью отделить комплекс РНК-белок dCas9 от целевой dsDNA. [44] dCas9 был нацелен с помощью сконструированных одиночных направляющих РНК на сайты инициации транскрипции любых локусов, где dCas9 может конкурировать с РНК-полимеразой на промоторах, чтобы остановить транскрипцию. [45] Кроме того, dCas9 может быть нацелен на кодирующую область локусов таким образом, что ингибирование РНК-полимеразы происходит во время фазы элонгации транскрипции. [45] У эукариот подавление экспрессии генов может быть расширено путем нацеливания dCas9 на последовательности энхансеров, где dCas9 может блокировать сборку факторов транскрипции, что приводит к подавлению экспрессии определенных генов. [12] Более того, направляющие РНК, предоставленные dCas9, могут быть разработаны для включения определенных несоответствий в его комплементарную родственную последовательность, что количественно ослабит взаимодействие dCas9 с его запрограммированной родственной последовательностью, позволяя исследователю настраивать степень подавления гена, применяемую к интересующему гену. [45] Эта технология в принципе похожа на РНК-интерференцию , так что экспрессия гена модулируется на уровне РНК. Однако подход dCas9 приобрел большую популярность, поскольку существует меньше нецелевых эффектов и в целом более крупные и воспроизводимые эффекты подавления посредством использования dCas9 по сравнению с скринингами РНК-интерференции. [46] Более того, поскольку подход dCas9 к подавлению гена можно количественно контролировать, исследователь теперь может точно контролировать степень подавления интересующего гена, что позволяет ответить на большее количество вопросов о регуляции генов и стехиометрии генов .

Помимо прямого связывания dCas9 с транскрипционно чувствительными позициями локусов, dCas9 может быть слит с различными модуляторными доменами белков для выполнения множества функций. Недавно dCas9 был слит с белками ремоделирования хроматина (HDACs/HATs) для реорганизации структуры хроматина вокруг различных локусов. [45] Это важно для нацеливания на различные интересующие эукариотические гены, поскольку гетерохроматиновые структуры препятствуют связыванию Cas9. Кроме того, поскольку Cas9 может реагировать на гетерохроматин , предполагается, что этот фермент может быть дополнительно применен для изучения структуры хроматина различных локусов. [45] Кроме того, dCas9 использовался в скрининге генной репрессии по всему геному. Используя большие библиотеки направляющих РНК, способных нацеливаться на тысячи генов, были проведены генетические скрининги по всему геному с использованием dCas9. [47]

Другой метод подавления транскрипции с помощью Cas9 заключается в прямом расщеплении продуктов мРНК с помощью каталитически активного фермента Cas9. [48] Этот подход стал возможным благодаря гибридизации одноцепочечной ДНК с комплементарной последовательностью PAM для одноцепочечной ДНК, что позволяет получить сайт dsDNA-RNA PAM для связывания Cas9. Эта технология делает доступной возможность изолировать эндогенные транскрипты РНК в клетках без необходимости вызывать химические модификации РНК или методов маркировки РНК.

Активация транскрипции с помощью белков слияния dCas9

В отличие от генов подавления, dCas9 также может использоваться для активации генов при слиянии с факторами активации транскрипции. [45] Эти факторы включают субъединицы бактериальной РНК-полимеразы II и традиционные факторы транскрипции у эукариот. Недавно также были выполнены скрининги активации транскрипции по всему геному с использованием слияний dCas9, названных «CRISPRa» для активации. [47]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abc Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, Konermann S, Shehata SI, Dohmae N, Ishitani R, Zhang F, Nureki O (февраль 2014 г.). «Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК». Cell . 156 (5): 935–49. doi :10.1016/j.cell.2014.02.001. PMC  4139937 . PMID  24529477.
  2. ^ "Нобелевская премия по химии 2020 года". NobelPrize.org . Получено 2020-10-07 .
  3. ^ ab Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E (март 2011 г.). "CRISPR RNA maturation с помощью транскодируемой малой РНК и фактора хозяина RNase III". Nature . 471 (7340): 602–607. Bibcode :2011Natur.471..602D. doi :10.1038/nature09886. PMC 3070239 . PMID  21455174. 
  4. ^ abcdef Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (август 2012 г.). «Программируемая двухРНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете». Science . 337 (6096): 816–21. Bibcode :2012Sci...337..816J. doi :10.1126/science.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  5. ^ Oh HS, Diaz FM, Zhou C, Carpenter N, Knipe DM (2022-01-01). "CRISPR-Cas9, экспрессируемый в стабильно трансдуцированных клеточных линиях, способствует рекомбинации и отбору рекомбинантов вируса простого герпеса". Current Research in Virological Science . 3 : 100023. doi :10.1016/j.crviro.2022.100023. PMC 9629518 . PMID  36330462. 
  6. ^ abc Heler R, Samai P, Modell JW, Weiner C, Goldberg GW, Bikard D, Marraffini LA (март 2015 г.). «Cas9 определяет функциональные вирусные цели во время адаптации CRISPR-Cas». Nature . 519 (7542): 199–202. Bibcode :2015Natur.519..199H. doi :10.1038/nature14245. PMC 4385744 . PMID  25707807. 
  7. ^ Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S и др. (март 2007 г.). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Science . 315 (5819): 1709–12. Bibcode :2007Sci...315.1709B. doi :10.1126/science.1138140. hdl : 20.500.11794/38902 . PMID  17379808. S2CID  3888761.
  8. ^ ab Гарно Дж.Э., Дюпюи М.Э., Виллион М., Ромеро Д.А., Баррангу Р., Бояваль П., Фремо С., Хорват П., Магадан А.Х., Муано С. (ноябрь 2010 г.). «Бактериальная иммунная система CRISPR/Cas расщепляет ДНК бактериофага и плазмиды». Природа . 468 (7320): 67–71. Бибкод : 2010Natur.468...67G. CiteSeerX 10.1.1.451.9645 . дои : 10.1038/nature09523. PMID  21048762. S2CID  205222849. 
  9. ^ Уддин, Фатема; М. Рудин, Чарльз; Сен, Трипарна (август 2020 г.). «Генная терапия CRISPR: применение, ограничения и последствия для будущего». Frontiers in Oncology . 10 : 1387. doi : 10.3389/fonc.2020.01387 . PMC 7427626. PMID  32850447 . 
  10. ^ Mali P, Esvelt KM, Church GM (октябрь 2013 г.). «Cas9 как универсальный инструмент для инженерной биологии». Nature Methods . 10 (10): 957–63. doi :10.1038/nmeth.2649. PMC 4051438 . PMID  24076990. 
  11. ^ Mali P, Aach J, Stranges PB, Esvelt KM, Moosburner M, Kosuri S, Yang L, Church GM (сентябрь 2013 г.). «CAS9 транскрипционные активаторы для скрининга целевой специфичности и парные никазы для кооперативной генной инженерии». Nature Biotechnology . 31 (9): 833–8. doi :10.1038/nbt.2675. PMC 3818127 . PMID  23907171. 
  12. ^ ab Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (июль 2013 г.). "CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот". Cell . 154 (2): 442–51. doi :10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145 . PMID  23849981. 
  13. ^ Эсвельт КМ, Смидлер АЛ, Каттеручча Ф, Чёрч ГМ (июль 2014 г.). «О направляемых РНК генных драйвах для изменения диких популяций». eLife . 3 . doi : 10.7554/eLife.03401 . PMC 4117217 . PMID  25035423. 
  14. ^ Cyranoski D, Reardon S (22 апреля 2015 г.). «Китайские ученые генетически модифицируют человеческие эмбрионы». Nature . doi :10.1038/nature.2015.17378. S2CID  87604469.
  15. ^ Doudna JA, Mali P (2016). CRISPR-Cas: лабораторное руководство . Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. ISBN 9781621821304. OCLC  922914104.{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
  16. ^ Chen W, Page-McCaw PS (март 2019 г.). "Редактирование гена CRISPR/Cas9". AccessScience . McGraw-Hill Education. doi :10.1036/1097-8542.168060.
  17. ^ Эбина Х., Мисава Н., Канемура И., Коянаги И. (2013-08-26). «Использование системы CRISPR/Cas9 для разрушения латентного провируса ВИЧ-1». Scientific Reports . 3 (1): 2510. Bibcode : 2013NatSR...3E2510E. doi : 10.1038/srep02510. PMC 3752613. PMID  23974631 . 
  18. ^ Li H, Sheng C, Wang S, Yang L, Liang Y, Huang Y, Liu H, Li P, Yang C, Yang X, Jia L, Xie J, Wang L, Hao R, Du X, Xu D, Zhou J, Li M, Sun Y, Tong Y, Li Q, Qiu S, Song H (2017-03-22). "Удаление интегрированной ДНК вируса гепатита B с использованием CRISPR-Cas9". Frontiers in Cellular and Infection Microbiology . 7 : 91. doi : 10.3389/fcimb.2017.00091 . PMC 5360708. PMID  28382278. 
  19. ^ Deveau H, Garneau JE, Moineau S (2010-10-13). «Система CRISPR/Cas и ее роль во взаимодействиях фагов и бактерий». Annual Review of Microbiology . 64 (1). Annual Reviews: 475–493. doi :10.1146/annurev.micro.112408.134123. PMID  20528693.
  20. ^ Хорват П., Баррангу Р. (январь 2010 г.). «CRISPR/Cas, иммунная система бактерий и архей». Science . 327 (5962): 167–70. Bibcode :2010Sci...327..167H. doi :10.1126/science.1179555. PMID  20056882. S2CID  17960960.
  21. ^ Каргинов Ф.В., Ханнон Г.Дж. (январь 2010 г.). «Система CRISPR: защита бактерий и архей, управляемая малыми РНК». Molecular Cell . 37 (1): 7–19. doi :10.1016/j.molcel.2009.12.033. PMC 2819186 . PMID  20129051. 
  22. ^ Jensen ED, Ferreira R, Jakočiūnas T, Arsovska D, Zhang J, Ding L и др. (март 2017 г.). «Транскрипционное перепрограммирование в дрожжах с использованием dCas9 и комбинаторных стратегий gRNA». Microbial Cell Factories . 16 (1): 46. doi : 10.1186/s12934-017-0664-2 . PMC 5353793 . PMID  28298224. 
  23. ^ Pinto BS, Saxena T, Oliveira R, Méndez-Gómez HR, Cleary JD, Denes LT, McConnell O, Arboleda J, Xia G, Swanson MS, Wang ET (ноябрь 2017 г.). «Препятствование транскрипции расширенных микросателлитных повторов деактивированным Cas9». Molecular Cell . 68 (3): 479–490.e5. doi :10.1016/j.molcel.2017.09.033. PMC 6013302 . PMID  29056323. 
  24. ^ O'Geen H, Ren C, Nicolet CM, Perez AA, Halmai J, Le VM, Mackay JP, Farnham PJ, Segal DJ (сентябрь 2017 г.). «редактирование эпигенома на основе dCas9 предполагает, что приобретение метилирования гистонов недостаточно для репрессии целевого гена». Nucleic Acids Research . 45 (17): 9901–9916. doi :10.1093/nar/gkx578. PMC 5622328 . PMID  28973434. 
  25. ^ Lowder LG, Paul JW, Qi Y (2017). «Мультиплексная транскрипционная активация или репрессия в растениях с использованием систем на основе CRISPR-dCas9». Сети регуляции генов растений . Методы в молекулярной биологии. Т. 1629. С. 167–184. doi :10.1007/978-1-4939-7125-1_12. ISBN 978-1-4939-7124-4. PMID  28623586.
  26. ^ Barrangou R, Horvath P (июнь 2017 г.). «Десятилетие открытий: функции и приложения CRISPR». Nature Microbiology . 2 (7): 17092. doi :10.1038/nmicrobiol.2017.92. PMID  28581505. S2CID  19072900.
  27. ^ ab Jinek M, Jiang F, Taylor DW, Sternberg SH, Kaya E, Ma E, Anders C, Hauer M, Zhou K, Lin S, Kaplan M, Iavarone AT, Charpentier E, Nogales E, Doudna JA (март 2014 г.). "Структуры эндонуклеаз Cas9 выявляют конформационную активацию, опосредованную РНК". Science . 343 (6176): 1247997. doi :10.1126/science.1247997. PMC 4184034 . PMID  24505130. 
  28. ^ Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA (февраль 2012 г.). «Системы РНК-управляемого генетического подавления у бактерий и архей». Nature . 482 (7385): 331–8. Bibcode :2012Natur.482..331W. doi :10.1038/nature10886. PMID  22337052. S2CID  205227944.
  29. ^ Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F (ноябрь 2013 г.). «Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9». Nature Protocols . 8 (11): 2281–2308. doi :10.1038/nprot.2013.143. PMC 3969860 . PMID  24157548. 
  30. ^ ab Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M (сентябрь 2014 г.). «Структурная основа PAM-зависимого распознавания целевой ДНК эндонуклеазой Cas9». Nature . 513 (7519): 569–73. Bibcode :2014Natur.513..569A. doi :10.1038/nature13579. PMC 4176945 . PMID  25079318. 
  31. ^ Макарова КС, Гришин НВ, Шабалина СА, Вольф ЮИ, Кунин ЕВ (март 2006). "Предполагаемая иммунная система на основе РНК-интерференции у прокариот: вычислительный анализ предсказанного ферментативного аппарата, функциональные аналогии с эукариотической РНК-интерференцией и гипотетические механизмы действия". Biology Direct . 1 (1): 7. doi : 10.1186/1745-6150-1-7 . PMC 1462988 . PMID  16545108. 
  32. ^ Sundaresan R, Parameshwaran HP, Yogesha SD, Keilbarth MW, Rajan R (декабрь 2017 г.). «РНК-независимая активность расщепления ДНК Cas9 и Cas12a». Cell Reports . 21 (13): 3728–3739. doi :10.1016/j.celrep.2017.11.100. PMC 5760271 . PMID  29281823. 
  33. ^ Raper AT, Stephenson AA, Suo Z (февраль 2018 г.). «Функциональные идеи, раскрытые кинетическим механизмом CRISPR/Cas9». Журнал Американского химического общества . 140 (8): 2971–2984. doi :10.1021/jacs.7b13047. PMID  29442507.
  34. ^ Lee JK, Jeong E, Lee J, Jung M, Shin E, Kim YH и др. (август 2018 г.). «Направленная эволюция CRISPR-Cas9 для повышения его специфичности». Nature Communications . 9 (1): 3048. Bibcode :2018NatCo...9.3048L. doi :10.1038/s41467-018-05477-x. PMC 6078992 . PMID  30082838. 
  35. ^ Singh D, Wang Y, Mallon J, Yang O, Fei J, Poddar A и др. (апрель 2018 г.). «Механизмы улучшенной специфичности сконструированных Cas9, выявленные с помощью анализа FRET отдельных молекул». Nature Structural & Molecular Biology . 25 (4): 347–354. doi :10.1038/s41594-018-0051-7. PMC 6195204 . PMID  29622787. 
  36. ^ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (август 2012 г.). «Программируемая двухРНК-направляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете». Science . 337 (6096): 816–21. Bibcode :2012Sci...337..816J. doi :10.1126/science.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  37. ^ Ким Н, Ким ХК, Ли С и др. (2020). «Прогнозирование активности расщепления, специфичной для последовательности вариантов Cas9». Nat Biotechnol . 38 (11): 1328–1336. doi :10.1038/s41587-020-0537-9. PMID  32514125. S2CID  219542792.
  38. ^ abc Corsi GI, Qu K, Alkan F, Pan X, Luo Y, Gorodkin J (май 2022 г.). "Активность CRISPR/Cas9 gRNA зависит от изменений свободной энергии и целевого контекста PAM". Nature Communications . 13 (3006): 3006. Bibcode :2022NatCo..13.3006C. doi : 10.1038/s41467-022-30515-0 . PMC 9151727 . PMID  35637227. 
  39. ^ Xu H, Xiao T, Chen CH, Li W, Meyer CA, Wu Q, Wu D, Cong L, Zhang F, Liu JS, Brown M, Liu XS (август 2015 г.). «Детерминанты последовательности улучшенного дизайна sgRNA CRISPR». Genome Res . 25 (8): 1147–1157. doi :10.1101/gr.191452.115. PMC 4509999. PMID 26063738  . 
  40. ^ Xiang X, Corsi, GI, Anthon C, Qu K, Pan X, Liang X, Han P, Dong Z, Liu L, Zhong J, Ma T, Wang J, Zhang X, Jiang H, Xu F, Liu X, Xu X, Wang J, Yang H, Bolund L, Church GM, Lin L, Gorodkin J, Luo Y (май 2021 г.). "Улучшение прогнозирования эффективности CRISPR-Cas9 gRNA путем интеграции данных и глубокого обучения". Nature Communications . 12 (1): 3238. Bibcode :2021NatCo..12.3238X. doi : 10.1038/s41467-021-23576-0 . PMC 8163799 . PMID  34050182. 
  41. ^ Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J (октябрь 2018 г.). «Оценка нецелевого воздействия CRISPR-Cas9 с параметрами энергии дуплекса нуклеиновой кислоты». Genome Biology . 19 (177): 177. doi : 10.1186/s13059-018-1534-x . PMC 6203265 . PMID  30367669. 
  42. ^ Тим SB, Ахметова L, Монтегю TG, Вален E, Шир AF (июнь 2016 г.). «Взаимодействия внутренних направляющих РНК мешают расщеплению, опосредованному Cas9». Nature Communications . 7 (11750): 11750. Bibcode :2016NatCo...711750T. doi :10.1038/ncomms11750. PMC 4906408 . PMID  27282953. 
  43. ^ Kusano K, Naito T, Handa N, Kobayashi I (ноябрь 1995 г.). «Системы рестрикции-модификации как геномные паразиты в конкуренции за определенные последовательности». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (24): 11095–9. Bibcode : 1995PNAS...9211095K. doi : 10.1073 /pnas.92.24.11095 . PMC 40578. PMID  7479944. 
  44. ^ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA (март 2014 г.). «Исследование ДНК с помощью эндонуклеазы Cas9, управляемой CRISPR РНК». Nature . 507 (7490): 62–7. Bibcode :2014Natur.507...62S. doi :10.1038/nature13011. PMC 4106473 . PMID  24476820. 
  45. ^ abcdef Bikard D, Jiang W, Samai P, Hochschild A, Zhang F, Marraffini LA (август 2013 г.). «Программируемое подавление и активация экспрессии бактериальных генов с использованием сконструированной системы CRISPR-Cas». Nucleic Acids Research . 41 (15): 7429–37. doi :10.1093/nar/gkt520. PMC 3753641. PMID  23761437 . 
  46. ^ Heintze J, Luft C, Ketteler R (2013). "A CRISPR CASe for high-throughput silencing". Frontiers in Genetics . 4 : 193. doi : 10.3389/fgene.2013.00193 . PMC 3791873. PMID  24109485 . 
  47. ^ ab Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, Guimaraes C, Panning B, Ploegh HL, Bassik MC, Qi LS, Kampmann M, Weissman JS (октябрь 2014 г.). "Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation". Cell . 159 (3): 647–61. doi :10.1016/j.cell.2014.09.029. PMC 4253859 . PMID  25307932. 
  48. ^ O'Connell MR, Oakes BL, Sternberg SH, East-Seletsky A, Kaplan M, Doudna JA (декабрь 2014 г.). «Программируемое распознавание и расщепление РНК с помощью CRISPR/Cas9». Nature . 516 (7530): 263–6. Bibcode :2014Natur.516..263O. doi :10.1038/nature13769. PMC 4268322 . PMID  25274302. 

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки