Хромосомный прыжок — это инструмент молекулярной биологии, который используется в физическом картировании геномов . Он связан с несколькими другими инструментами, используемыми для той же цели, включая ходьбу по хромосоме .
Хромосомный прыжок используется для обхода областей, которые трудно клонировать , например, содержащих повторяющуюся ДНК , которые не могут быть легко отображены с помощью хромосомного обхода, и полезен для быстрого перемещения по хромосоме в поисках определенного гена . В отличие от хромосомного обхода, хромосомный прыжок может начинаться в одной точке хромосомы, чтобы пересечь потенциально удаленную точку той же хромосомы без клонирования промежуточных последовательностей. [1] Концы большого фрагмента ДНК являются целевой секцией клонирования хромосомного прыжка, в то время как средняя часть удаляется последовательностями химических манипуляций перед этапом клонирования. [2]
Хромосомный прыжок позволяет клонировать два конца последовательности ДНК без средней части. Геномная ДНК может быть частично переварена с использованием эндонуклеазы рестрикции, а с помощью ДНК-лигазы фрагменты кольцевидизируются при низкой концентрации. [2] [3] Из известной последовательности праймер разрабатывается для последовательности через кольцевидное соединение. Этот праймер используется для прыжка на интервалы 100 кб -300 кб: последовательность на расстоянии 100 кб приблизилась бы к известной последовательности при кольцевидизации, он позволяет совершать прыжки и секвенирование альтернативным способом. Таким образом, последовательности, недоступные для обхода хромосомы, могут быть секвенированы. [2] Хромосомный обход также может использоваться из новой позиции прыжка (в любом направлении) для поиска геноподобных последовательностей, или могут использоваться дополнительные прыжки для дальнейшего продвижения по хромосоме. Объединение прыжка хромосомы с обходом хромосомы через хромосому позволяет обходить повторяющуюся ДНК для поиска целевого гена.
Библиотека прыжков хромосом отличается от ходьбы по хромосомам из-за манипуляций, выполняемых до этапа клонирования . Для того, чтобы построить библиотеку прыжков хромосом, отдельные клоны берут начало из случайных точек в геноме (общие библиотеки прыжков первый базовый протокол) или из концов определенных рестрикционных фрагментов (специфические библиотеки прыжков альтернативный протокол) должны быть идентифицированы. [1] [4]
Одним из примеров создания библиотеки является классифицированная как редкощепящая эндонуклеаза рестрикции, такая как NotI. [5] [6] Для того чтобы построить и охарактеризовать библиотеку на основе переваренной NotI человеческой ДНК, случайные клоны были проанализированы с помощью рестрикционного картирования . [3] Из-за широкого распределения размеров фрагментов, полученных при полном переваривании NotI, библиотека была разделена на две фракции, с низкой и высокой концентрацией плазмиды. [3] Клоны, обладающие уникальными концевыми фрагментами, затем были проанализированы с помощью гибридизации с Саузерн-блотами в градиенте пульсирующего поля (PFG) . [3] Изучая результаты, полученные для одинарных и двойных перевариваний человеческой ДНК ферментами NotI, BssHII и NruI, была создана рестрикционная карта с областью размером 850 кб, содержащей связывающие и прыгающие клоны. [3] Кроме того, фрагменты NotI с прыжками в 250 и 350 кб были очевидны в двух конечных клонах, полученных в соответствии с генетическими расстояниями 0,25 и 0,35 сМ. [3]
Преимущества прыжка хромосом:
Однако, несмотря на эти преимущества, хромосомный скачок все еще ограничен емкостью клонирующего вектора , которая представляет собой расстояние между концами двух фрагментов, которое может составлять приблизительно сотни килобаз. [2] Кроме того, поскольку скачок не клонирует промежуточную ДНК, для идентификации всех генов, присутствующих в ДНК, необходимо провести хромосомный скачок. [7] Несмотря на это, он все еще считается полезным из-за возможности скачка более чем на сотни килобаз по сравнению с хромосомным скачком.
Библиотеки прыжков хромосом помогают устранить сложность стандартных методов клонирования с большими молекулярными расстояниями. Этот процесс дал возможность использовать библиотеку прыжков хромосом для других генетических заболеваний, требующих прыжков на 100 килобаз. [4] В частности, для генетических заболеваний, таких как кистозный фиброз , его ген расположен в человеческой хромосоме 7 , удалось использовать библиотеку прыжков хромосом для поиска прыгающего клона, мет-онкогена. [4] Идентификация кистозного фиброза была затруднена из-за его существования в эукариотических генах, которые состоят из кодирующих (экзоны) и некодирующих (интроны) сегментов, где интроны имеют небольшой размер, что затрудняет их обнаружение. [7] Другая проблема в распознавании гена кистозного фиброза заключается в том, что клетки млекопитающих содержат множество повторяющихся ДНК, что может привести к неправильному клонированию и блокировке репликации ДНК , а также может вызвать нестабильность. [8] Оба эти осложнения традиционные методы клонирования не способны обработать, поскольку для получения сигнала для идентификации гена муковисцидоза необходимо было бы увидеть большой выход экзонов, а ДНК должна была бы быть свободна от любых повторяющихся элементов. [7]