Клоногенный анализ — это метод клеточной биологии для изучения эффективности специфических агентов в отношении выживания и пролиферации клеток. Он часто используется в лабораториях по исследованию рака для определения влияния лекарств или радиации на пролиферирующие опухолевые клетки [1] , а также для титрования частиц, убивающих клетки (CKP), в вирусных штаммах. [2] Впервые он был разработан Т. Т. Паком и Филиппом И. Маркусом в Университете Колорадо в 1955 году. [3]
Хотя этот метод может дать точные результаты, анализ требует много времени для настройки и анализа и может предоставить данные только о тех опухолевых клетках, которые могут расти в культуре. Слово «клоногенный» относится к тому факту, что эти клетки являются клонами друг друга.
Эксперимент включает три основных этапа:
В конце эксперимента измеряется процент клеток, выживших после лечения. Графическое представление выживаемости в зависимости от концентрации препарата или дозы ионизирующего излучения называется кривой выживаемости клеток . [4]
В анализах с использованием частиц, убивающих клетки, выжившая фракция клеток используется для аппроксимации распределения Пуассона вирусных частиц среди клеток и, следовательно, определения количества CKP, с которыми сталкивается каждая клетка.
Любой тип клеток может быть использован в эксперименте, но поскольку целью этих экспериментов в онкологических исследованиях является открытие более эффективных методов лечения рака, типичным выбором являются человеческие опухолевые клетки. Клетки берутся либо из подготовленных «клеточных линий», которые хорошо изучены и чьи общие характеристики известны, либо из биопсии опухоли у пациента. [5] Клетки помещаются в чашки Петри или в планшеты, которые содержат несколько круглых «лунок». Определенное количество клеток высевается в зависимости от эксперимента; для эксперимента, включающего облучение, обычно высевают большее количество клеток с увеличивающейся дозой радиации. Например, при дозе радиации 0 или 1 грей можно высеять 500 клеток, но при 4 или 5 грей можно высеять 2500, поскольку очень большое количество клеток погибает при этом уровне радиации, и эффекты конкретного лечения будут незаметны.
Подсчет колоний клеток обычно производится под микроскопом и является довольно утомительным. Недавно были разработаны машины, которые используют алгоритмы для анализа изображений. [6] Они либо захватываются сканером изображений , либо автоматизированным микроскопом, который может полностью автоматизировать процесс подсчета. [7] Одна из таких автоматизированных машин работает, принимая определенные типы клеточных пластин через щель (не так, как в CD-плеере), делая фотографию и загружая ее на компьютер для немедленного анализа. Надежные подсчеты доступны в течение нескольких секунд.
Лечение обычно представляет собой лекарственное средство , ионизирующее излучение или их комбинацию. [8] Некоторые современные исследования изучают потенцирование эффектов лекарственных средств одновременным облучением — синергический эффект — и в этой ситуации изучаются две группы: контрольная группа, которая не лечится лекарственным средством; и лечебная группа, которая лечится лекарственным средством. Обе группы облучаются. Если наклоны их кривых выживаемости значительно различаются, то потенцирующий эффект может быть очевиден и может быть изучен далее. Поскольку многие опухолевые клетки не будут выращивать колонии в культуре, анализ пролиферации клеток, который, как сообщается, имеет удовлетворительную точность в измерении синергических эффектов между ионизирующим излучением и лекарственными средствами, может быть использован в качестве суррогата [9]
Подробное обсуждение перспективных исследований, проводимых с помощью этой методики, выходит за рамки данного текста, но некоторые исследования включают в себя изучение влияния экспрессии определенных генов или рецепторов на клетку, реакции различных типов клеток или синергические эффекты нескольких препаратов.