DARPins ( аббревиатура от «созданные белки с анкириновыми повторами ») представляют собой генно-инженерные белки -миметики антител , обычно демонстрирующие высокоспецифическое и высокоаффинное связывание с целевыми белками . Они происходят из природных белков-повторов анкирина , одного из наиболее распространенных классов связывающих белков в природе, которые отвечают за разнообразные функции, такие как передача сигналов в клетке, регуляция и структурная целостность клетки. DARPins состоят как минимум из трех повторяющихся мотивов или модулей, из которых большинство N- и большинство C-концевых модулей называются «кэпами», поскольку они защищают гидрофобное ядро белка. Количество внутренних модулей обозначается цифрами (например, N1C, N2C, N3C, ...), а колпачки обозначаются буквами «N» или «C» соответственно. Молекулярная масса , например, 14 или 18 кДа ( килодальтоны ) для четырех-(N2C) или пяти-(N3C) повторов DARPins довольно мала для биологического препарата (около 10% размера IgG ) .
DARPins представляют собой новый класс мощных, специфических и универсальных низкобелковых терапевтических средств и используются в качестве исследовательских инструментов в различных исследовательских, диагностических и терапевтических целях. [1] Molecular Partners AG , биофармацевтическая компания клинической стадии с несколькими молекулами DARPin в клинической и доклинической разработке, в настоящее время занимается собственной разработкой терапевтических DARPins ( прямая интеграция ). Athebio AG продолжает совершенствовать платформу DARPin, используя модель партнерства . [2]
Кроме того, DARPins можно использовать в качестве шаперонов кристаллизации для растворимых и мембранных белков, включая рецепторы, связанные с G-белками (GPCR), либо в качестве партнеров по связыванию, либо в качестве жестких слияний с целевым белком. Эта концепция теперь расширяется до определения структуры с помощью криоЭМ. [3] [4] [5] [6]
Платформа DARPin была открыта и разработана в лаборатории Андреаса Плюктуна в Цюрихском университете , Швейцария , во время изучения техники и библиотек рекомбинантных антител. [7] DARPins получены из встречающихся в природе белков анкиринов, класса белков, которые в природе опосредуют белок-белковые взаимодействия с высоким сродством .
Библиотеки DARPin были разработаны путем выравнивания последовательностей нескольких тысяч природных анкириновых повторяющихся мотивов (около 33 аминокислот каждый) в сочетании с методами структурного проектирования и рекомбинантной ДНК . [7] Эти белки состоят из повторяющихся структурных единиц, которые образуют стабильный белковый домен с большой потенциальной поверхностью взаимодействия с мишенью. Обычно DARPins содержат четыре или пять повторов, из которых первый (N-кэпирующий повтор) и последний (C-кэпирующий повтор) служат для защиты гидрофобного белкового ядра от водной среды. DARPins соответствуют среднему размеру природных белковых доменов с анкириновыми повторами. Белки с менее чем тремя повторами (т.е. кэп-повторами и одним внутренним повтором) не образуют достаточно стабильной третичной структуры. [8] Молекулярная масса дарпина зависит от общего количества повторов, как показано в следующей таблице:
На уровне ДНК были созданы библиотеки DARPins со рандомизированными остатками потенциального взаимодействия с мишенью, с разнообразием более 10–12 вариантов . Из этих библиотек биохимики могут выбрать DARPins для связывания выбранной мишени с пикомолярным сродством , а специфичность может быть выбрана с использованием рибосомного дисплея [9] или фагового дисплея [10] с использованием сигнальных последовательностей, обеспечивающих котрансляционную секрецию. [11] Дарпины могут действовать как агонисты рецепторов , антагонисты , обратные агонисты , ингибиторы ферментов или простые связыватели белков-мишеней. [1]
DARPins экспрессируются в цитоплазме Escherichia coli на высоких уровнях (более 10 г/л при ферментации, 1 г/л при встряхивании) в растворимой форме. [12] Белки обладают высокой термической и термодинамической стабильностью ( средняя точка денатурации : обычно равновесное разворачивание : ∆G > 9,5 ккал/моль ), которая увеличивается с увеличением числа повторов. [7] [13] [14] Дарпины стабильны в сыворотке крови человека и могут быть сконструированы таким образом, чтобы не содержать эпитопов Т-клеток .
Благодаря высокой специфичности, стабильности, активности и сродству, а также гибкой архитектуре, DARPins имеют режим связывания с жестким телом . [1] [9] Мультиспецифические или мультивалентные конструкции, полученные путем генетического слияния, позволяют предположить, что слитые DARPins обладают такими же связывающими свойствами, что и однодоменные DARPins. [1] Отсутствие цистеинов в каркасе позволяет создавать сайт-специфические цистеины, обеспечивая сайт-направленное связывание химических веществ с молекулой. С той же целью можно вводить неприродные аминокислоты. [15]
Потенциально дарпины могут принести клиническую пользу, преодолев ограничения традиционных терапевтических подходов, которые обычно нацелены на один путь заболевания и, таким образом, могут поставить под угрозу эффективность. Во многих случаях сложность заболевания является результатом нарушения регуляции нескольких путей. Технологию DARPin можно использовать для быстрого создания тысяч различных «мульти-DARPin», где связывающие домены соединены (т.е. линкерами), тем самым позволяя воздействовать на несколько путей заболевания. DARPins и мульти-DARPin также могут быть слиты с не-DARPin-элементами, такими как токсин, [16] для создания таргетных терапевтических средств, а их производству способствует устойчивость DARPin к агрегации. Разнообразие форматов и надежность мульти-DARPins облегчают эмпирический подход (например, посредством скрининга на основе результатов) для эффективной идентификации DARPins с потенциальной активностью в конкретных путях заболевания.
Потенциальные преимущества дарпинов во многом обусловлены их структурными и биофизическими характеристиками. Считается, что их небольшой размер (14–18 кДа) обеспечивает повышенное проникновение в ткани, а их высокая активность (<5–100 пМ) делает дарпины активными при низких концентрациях. [17] Дарпины растворимы при концентрации >100 г/л, а их высокая стабильность и растворимость считаются желательными свойствами для лекарственных соединений. DARPins можно производить быстро и экономически эффективно (т.е. из E.coli ). Их фармакокинетические (ФК) свойства можно регулировать путем слияния с молекулами, увеличивающими период полувыведения, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или с дарпинами, связывающимися с сывороточным альбумином человека. Из-за своих благоприятных биофизических свойств [1] DARPins считаются легко разрабатываемыми с использованием стандартных процессов и потенциально демонстрируют устойчивое классовое поведение.
Дарпины использовались в качестве исследовательских инструментов [1] , в качестве диагностических средств [17] и в качестве терапевтических средств. [18] [19] [20] [21] MP0112, первый кандидат на дарпин в клинике, является ингибитором фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и вступил в клинические испытания для лечения влажной возрастной дегенерации желтого пятна (влажная ВМД, также известный как неоваскулярная возрастная макулярная дегенерация) [16] и диабетический макулярный отек [22] в начале 2010 года.
В настоящее время MP0112 исследуется в трех различных клинических испытаниях. Первые два исследования представляют собой исследования безопасности и эффективности абиципара у пациентов с влажной ВМД с целью установления сопоставимости между японскими и неяпонскими пациентами. [18] [20] Третье исследование направлено на проверку безопасности и эффективности абиципара у пациентов с ДМО. [19]
В июле 2014 года компания Molecular Partners инициировала первое исследование на людях для изучения безопасности, переносимости и уровня в крови MP0250, второго кандидата на дарпин, у больных раком. [21]
Компания Molecular Partners AG имеет несколько дополнительных дарпинов, находящихся на доклинической разработке, с потенциальными показаниями для применения в различных областях заболеваний, включая офтальмологию , онкологию , иммуноонкологию и иммунологию .