Электрофорез в градиенте температуры ( TGGE ) и электрофорез в градиенте температуры в геле ( DGGE ) — это формы электрофореза , в которых для денатурации образца по мере его перемещения по акриламидному гелю используется либо температурный, либо химический градиент. TGGE и DGGE можно применять к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК , а также (реже) к белкам. TGGE основан на зависящих от температуры изменениях структуры для разделения нуклеиновых кислот . DGGE разделяет гены одинакового размера на основе их различной денатурирующей способности, которая определяется последовательностью пар оснований. DGGE был оригинальной методикой, а TGGE — ее усовершенствованием.
DGGE был изобретен Леонардом Лерманом , когда он был профессором в Университете штата Нью-Йорк в Олбани. [1] [2] [3]
Это же оборудование можно использовать для анализа белка , что впервые было сделано Томасом Э. Крейтоном из Лаборатории молекулярной биологии MRC , Кембридж, Англия. [4] Схожие узоры производятся белками и нуклеиновыми кислотами, но фундаментальные принципы совершенно различны.
TGGE впервые описали Тэтчер и Ходсон [5] и Роджер Уортелл из Georgia Tech. Обширная работа была проделана группой Райснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE доступно от Bio-Rad, INGENY и CBS Scientific; система для TGGE доступна от Biometra.
ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому будет двигаться к положительному электроду в электрическом поле. Гель представляет собой молекулярную сетку с отверстиями примерно такого же размера, как диаметр нити ДНК. При приложении электрического поля ДНК начнет двигаться через гель со скоростью, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткие отрезки ДНК перемещаются быстрее) — это основа для разделения, зависящего от размера, в стандартном электрофорезе .
В TGGE также существует температурный градиент по всему гелю. При комнатной температуре ДНК будет стабильно существовать в двухцепочечной форме. По мере повышения температуры нити начинают разделяться ( плавиться ), и скорость, с которой они движутся через гель, резко уменьшается. Критически важно, что температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (пары оснований GC более стабильны, чем AT, из-за стекинг-взаимодействий, а не из-за разницы в водородных связях [ необходима цитата ] (между парой оснований цитозина и гуанина существует три водородных связи , но только две между аденином и тимином )), поэтому TGGE обеспечивает «зависимый от последовательности, независимый от размера метод» для разделения молекул ДНК. TGGE разделяет молекулы и дает дополнительную информацию о поведении и стабильности плавления (Biometra, 2000).
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) работает путем нанесения небольшого образца ДНК (или РНК) на электрофорезный гель, содержащий денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что некоторые денатурирующие гели способны вызывать плавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на наличие отдельных компонентов, даже таких маленьких, как 200-700 пар оснований .
Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным денатурирующим условиям, расплавленные нити полностью фрагментируются на отдельные нити. Процесс денатурации в денатурирующем геле очень резкий: «Вместо того, чтобы частично плавиться непрерывно, как застежка-молния, большинство фрагментов плавятся поэтапно. Отдельные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий» (Helms, 1990). Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательностях фрагментов одинаковой длины часто приводят к их частичному плавлению в разных положениях градиента и, следовательно, «остановке» в разных положениях в геле. Сравнивая поведение плавления полиморфных фрагментов ДНК бок о бок в денатурирующих градиентных гелях, можно обнаружить фрагменты, которые имеют мутации в первом домене плавления (Helms, 1990). Поместив два образца рядом на гель и дав им возможность денатурировать вместе, исследователи могут легко увидеть даже самые незначительные различия в двух образцах или фрагментах ДНК.
У этой методики есть ряд недостатков: «Химические градиенты, такие как те, что используются в DGGE, не так воспроизводимы, их трудно установить, и они часто не полностью разрешают гетеродуплексы » (Westburg, 2001). Эти проблемы решаются с помощью TGGE, который использует температурный, а не химический градиент для денатурации образца.
Для разделения нуклеиновых кислот с помощью TGGE необходимо выполнить следующие шаги: приготовление и заливка гелей, электрофорез, окрашивание и элюирование ДНК. Поскольку необходимо выбрать буферную систему, важно, чтобы система оставалась стабильной в условиях повышения температуры. Таким образом, для приготовления геля обычно используют мочевину ; однако исследователям необходимо знать, что количество используемой мочевины повлияет на общую температуру, необходимую для разделения ДНК. [6] Гель загружается, образец помещается на гель в соответствии с типом геля, который обрабатывается — то есть параллельно или перпендикулярно — напряжение регулируется, и образец можно оставить для обработки. [6] В зависимости от того, какой тип TGGE будет обрабатываться, перпендикулярно или параллельно , необходимо подготовить и загрузить различные количества образца. Большее количество одного образца используется при перпендикулярном TGGE, в то время как меньшее количество многих образцов используется при параллельном TGGE. После обработки геля гель необходимо окрасить для визуализации результатов. Хотя существует ряд красителей, которые можно использовать для этой цели, наиболее эффективным инструментом оказалось окрашивание серебром . [6] ДНК можно элюировать из серебряного красителя для дальнейшего анализа с помощью ПЦР- амплификации. [6]
TGGE и DGGE широко используются в биомедицинских и экологических исследованиях; некоторые области применения описаны ниже.
Согласно недавнему исследованию Вонга, Ляна, Квона, Бая, Альпера и Гропмана, [7] TGGE можно использовать для изучения митохондриальной ДНК человека. По словам этих авторов, TGGE использовался для определения двух новых мутаций в митохондриальном геноме : «21-летняя женщина, у которой подозревали митохондриальную цитопатию, но которая не имела точечных мутаций и делеций общей митохондриальной ДНК (мтДНК), была обследована на неизвестные мутации во всем митохондриальном геноме с помощью электрофореза в градиенте температуры». [8]
Лор и его коллеги (2001) сообщают [ требуется ссылка ] , что в комплексном исследовании панкреатических секретов людей без панкреатической карциномы мутации p53 могли быть обнаружены в панкреатическом соке небольшого процента участников. Поскольку мутации p53 широко обнаруживаются в панкреатических карциномах, исследователи этого исследования пытались определить, может ли сама мутация быть связана с развитием рака поджелудочной железы. Хотя Лор смог найти мутации p53 с помощью TGGE у нескольких субъектов, ни у одного из них впоследствии не развилась панкреатическая карцинома. Таким образом, исследователи делают вывод, отмечая, что мутация p53 может быть не единственным индикатором онкогенеза панкреатической карциномы.
DGGE генов, кодирующих малые субъединицы рибосом, был впервые описан Джерардом Мейзером [9] , когда он был постдокторантом в Лейденском университете , и стал широко используемым методом в микробной экологии.
ПЦР-амплификация ДНК, выделенной из смешанных микробных сообществ, с использованием ПЦР-праймеров, специфичных для фрагментов гена 16S рРНК бактерий и архей , а также фрагментов гена 18S рРНК эукариот, приводит к образованию смесей продуктов ПЦР. Поскольку все эти ампликоны имеют одинаковую длину, их невозможно отделить друг от друга с помощью электрофореза в агарозном геле. Однако вариации последовательностей (т. е. различия в содержании и распределении ГЦ) между различными микробными рРНК приводят к различным свойствам денатурации этих молекул ДНК.
Следовательно, паттерны полос DGGE можно использовать для визуализации вариаций в микробном генетическом разнообразии и получения приблизительной оценки богатства распространенности преобладающих членов микробного сообщества. Этот метод часто называют дактилоскопией сообщества . Недавно несколько исследований показали, что DGGE функциональных генов (например, генов, участвующих в восстановлении серы, фиксации азота и окислении аммония) может предоставить информацию о микробной функции и филогении одновременно. Например, Табатабаей и др. (2009) применили DGGE и впервые смогли выявить микробный паттерн во время анаэробной ферментации стоков завода по производству пальмового масла (POME). [10]