DnaA — белок, который активирует инициацию репликации ДНК у бактерий. [1] Согласно модели репликона, положительно активная молекула-инициатор контактирует с определенным местом на кольцевой хромосоме, называемым репликатором, чтобы начать репликацию ДНК. [2] Это фактор инициации репликации, который способствует раскручиванию ДНК в oriC. [1] Белки DnaA, обнаруженные во всех бактериях, взаимодействуют с коробками DnaA, чтобы начать репликацию хромосом. Помимо белка DnaA, его концентрации, связывания с DnaA-боксами и связывания АТФ или АДФ, мы рассмотрим регуляцию гена DnaA, уникальные характеристики экспрессии гена DnaA, силу промотора и эффективность трансляции. [2] Начало фазы инициации репликации ДНК определяется концентрацией DnaA. [1] ДНКА накапливается во время роста, а затем запускает инициацию репликации. [1] Репликация начинается с активного связывания ДНК с 9-мерными повторами (9 пар оснований) выше oriC. [1] Связывание ДНКА приводит к разделению цепи в 13-мерных повторах. [1] Это связывание заставляет ДНК сворачиваться в петлю, готовясь к открытию хеликазой DnaB. [1]
ДНКА состоит в основном из двух разных форм: активной АТФ -формы и неактивной АДФ . [1] [3] Уровень активной ДНКА внутри клетки низкий сразу после деления клетки. [1] Хотя активная форма DnaA требует АТФ, образование комплекса oriC /DnaA и последующее раскручивание ДНК не требует гидролиза АТФ . [4]
Сайт oriC в E. coli имеет три богатые АТ области по 13 пар оснований ( DUE ), за которыми следуют четыре области по 9 пар оснований с последовательностью TTAT( C или A)CA(C или A)A. [5] Около 10 молекул ДНКА связываются с областями длиной 9 пар оснований, которые обертываются вокруг белков, заставляя ДНК в богатой АТ области раскручиваться. В oriC имеется 8 сайтов связывания DnaA , с которыми DnaA связывается с дифференциальным сродством. Когда репликация ДНК вот-вот начнется, DnaA занимает все сайты связывания с высоким и низким сродством. Денатурированная богатая АТ область позволяет рекрутировать DnaB ( геликазу ), которая образует комплекс с DnaC (загрузчик геликазы). DnaC помогает хеликазе связываться и правильно приспосабливаться к оцДНК в области 13 п.н.; это достигается путем гидролиза АТФ , после которого высвобождается DnaC. Однонитевые связывающие белки (SSB) стабилизируют отдельные цепи ДНК, чтобы поддерживать репликационный пузырь . DnaB представляет собой хеликазу 5'→3', поэтому она движется по отстающей цепи . Он связывается с DnaG ( примазой ), образуя единственный праймер для ведущей цепи и добавляя праймеры РНК к отстающей цепи. Взаимодействие между DnaG и DnaB необходимо для контроля долготы фрагментов Оказаки на отстающей цепи. ДНК-полимераза III затем может начать репликацию ДНК .
ДНКА состоит из четырех доменов: первый — N-концевой, который связывается с регуляторными белками, второй — область спирального линкера, третий домен — это область ААА+, которая связывается с АТФ, и четвертый домен — С-концевой. Область связывания ДНК. [6] ДНКА содержит два консервативных участка: первый расположен в центральной части белка и соответствует АТФ-связывающему домену, второй расположен в С-концевой половине и участвует в ДНК-связывании. [7]
Первыми штаммами, у которых был мутирован ген dnaA, были термочувствительные штаммы K-12 CRT46 и CRT83, соответствующие номера штаммов - dnaA46 и dnaA83. В отличие от мутантов dnaA, штамм PC2 имеет мутацию в гене dnaC, который кодирует фактор загрузки ДНК-хеликазы dnaB. [8]
ДНКА обладает способностью связывать собственный промотор . Когда DnaA связывается со своим собственным промотором, она блокирует связывание РНК-полимеразы с промотором и ингибирует инициацию транскрипции . Таким образом, ДНКА способна регулировать собственную экспрессию. [3] [9] Этот процесс называется авторегуляцией . [10]
Каждый цикл клеточного деления запускает новый раунд репликации хромосом с помощью ДНКА, белка-инициатора. Крайне важно регулировать взаимодействия мономера DnaA-ATP с oriC во время загрузки хеликазы и раскручивания исходной ДНК для точного времени. Сайты узнавания DnaA в Escherichia coli расположены в OriC, чтобы облегчить поэтапную сборку предрепликационного комплекса, при этом DnaA взаимодействует с сайтами с низким сродством во время олигомеризации, заполняя промежутки между сайтами с высоким сродством по мере олигомеризации. Могут существовать многочисленные стратегии заполнения пробелов, позволяющие связать функции OriC с образом жизни бактерий в природе, что может объяснять широкую изменчивость паттернов сайтов узнавания OriC DnaA. [11] Две формы ДНКА, активная АТФ- и АДФ -форма регулируются. АТФ -форма преобразуется в АДФ - форму путем либо регуляторной инактивации ДНКА (RIDA), [12] которая, в свою очередь, состоит из белка Hda и скользящего зажима β ( DnaN ) [13] , либо datA- зависимой ДНК-АТФ. гидролиз. [14] АДФ-форма преобразуется в АТФ-форму с помощью ДНК-реактивирующих последовательностей 1 и 2 (DARS1 и DARS2). [15]
В белке ДНКА есть четыре дисциплины. Первоначальное сравнение белков Escherichia coli и Bacillus subtilis привело к открытию сферической структуры, которая выявила относительно консервативный N-конец и в значительной степени консервативный большой C-конец, разделенный областью, которая в основном была вариабельной. [16] Например, белки энтеробактерий имеют почти идентичные N- и C-концевые последовательности, однако для них характерны многочисленные аминокислотные корректировки, исключения и вставки в вариабельных областях. [17] В С-концевой области имеется мотив АТФазы семейства ААА+ и независимая ДНК-связывающая сфера. Методом ЯМР установлено, что сфера Escherichia coli IV в комплексе с DnaA-боксом имеет кристально чистую структуру. В результате было подтверждено, что список ДНК опосредован сочетанием мотива спираль-поворот-спираль и вводного круга. При связывании с АТФ, но не с АДФ, ДНКА образует суперспиральную структуру с четырьмя мономерами на виток. Структура сферы I была определена по трем дополнительным видам бактерий и Escherichia coli с помощью ЯМР. [18]
Исследования мутантов dnaA(Ts) предоставили первое доказательство авторегулирования гена dnaA. Белок ДНКА по-прежнему вырабатывается при недопустимых температурах, где он неактивен, но у некоторых мутантов его можно снова сделать активным, вернувшись к температуре, способствующей развитию. [17] Эту обратимую способность инициации, которая была больше, чем ожидалось, учитывая прирост массы культуры, можно было увидеть в отсутствии синтеза белка при пермиссивной температуре и предположить, что синтез белка DnaA подавлялся при высокой температуре роста. Эти результаты побудили к тщательному исследованию мутанта dnaA46 в пермиссивных, промежуточных и непермиссивных условиях развития. [19] Результаты исследования показали, что по мере повышения температуры роста активность белка DnaA46 снижается, что приводит к постепенному снижению концентрации ДНК и происхождения при промежуточных температурах. Увеличение способности инициации наблюдалось одновременно со снижением активности белка DnaA. Хансен и Расмуссен (1977) утверждали, что белок DnaA оказывает положительное влияние на инициацию репликации, поскольку транскрипты, входящие в ген dnaA, были обнаружены в результате секвенирования промоторной области dnaA и гена dnaA. [19] Промоторная область DnaA имеет девять сайтов GATC в пределах 225 пар оснований, а также последовательность, которая, согласно этим наблюдениям, играет отрицательную роль в собственном синтезе. Между двумя промоторами были обнаружены два промотора, обеспечивающие повторы (DnaA-боксы) в области oriC. По данным ряда исследований, белок DnaA отрицательно регулирует оба промотора. В этих исследованиях было обнаружено, что транскрипция dnaA усиливается в 4–5 раз при недопустимых температурах у мутантов dnaAT и подавляется в той же степени, когда белок DnaA вырабатывается в избытке. Для ауторегуляции гена dnaA необходим DnaA-бокс. [20] Последовательность промотора dnaA2p имеет некоторые интригующие характеристики, которые можно увидеть более четко. Этот промотор содержит два сайта GATC, один в последовательности 10, а другой в последовательности 35, и как in vivo, так и in vitro метилирование увеличивает транскрипцию с этого промотора в два раза. Кроме того, белок DnaA связывается с областями выше промотора dnaA2p с высоким сродством. [10]