Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) или электрофорез сдвига подвижности , также называемый анализом сдвига геля , анализом сдвига геля , анализом сдвига полосы или анализом задержки геля , является распространенной техникой аффинного электрофореза , используемой для изучения взаимодействий белок-ДНК или белок - РНК . Эта процедура может определить, способен ли белок или смесь белков связываться с заданной последовательностью ДНК или РНК, и иногда может указывать, участвует ли в связывающем комплексе более одной молекулы белка. Анализы сдвига геля часто проводятся in vitro одновременно с ДНКазным футпринтингом , удлинением праймера и экспериментами с промотором-зондом при изучении инициации транскрипции , репликации ДНК-группы, репарации ДНК или процессинга и созревания РНК, а также сплайсинга пре-мРНК. [1] Хотя предшественники можно найти в более ранней литературе, большинство современных анализов основаны на методах, описанных Гарнером и Ревзиным [2] и Фридом и Крозерсом [3] .
Анализ сдвига подвижности представляет собой электрофоретическое разделение смеси белок-ДНК или белок-РНК на полиакриламидном или агарозном геле в течение короткого периода (около 1,5-2 часов для геля толщиной 15-20 см). [4] Скорость, с которой различные молекулы (и их комбинации) движутся через гель, определяется их размером и зарядом, и в меньшей степени их формой (см. гель-электрофорез ). Контрольная полоса (зонд ДНК без присутствующего белка) будет содержать одну полосу, соответствующую несвязанному фрагменту ДНК или РНК. Однако, предполагая, что белок способен связываться с фрагментом, полоса с присутствующим связывающимся белком будет содержать другую полосу, которая представляет собой более крупный, менее подвижный комплекс зонда нуклеиновой кислоты, связанного с белком, который «смещен» вверх по гелю (так как он двигался медленнее).
При правильных экспериментальных условиях взаимодействие между ДНК (или РНК) и белком стабилизируется, и соотношение связанной и несвязанной нуклеиновой кислоты в геле отражает долю свободных и связанных молекул зонда по мере того, как реакция связывания входит в гель. Эта стабильность частично обусловлена «эффектом клетки», в том смысле, что белок, окруженный матрицей геля, не может диффундировать от зонда до того, как они рекомбинируют. [5] Если известны начальные концентрации белка и зонда, и если известна стехиометрия комплекса, можно определить кажущееся сродство белка к последовательности нуклеиновой кислоты. [6] Если комплекс не является очень долгоживущим в условиях геля или не принимается во внимание диссоциация во время электрофореза, полученное число является кажущимся Kd. Если концентрация белка неизвестна, но известна стехиометрия комплекса, концентрацию белка можно определить, увеличивая концентрацию зонда ДНК до тех пор, пока дальнейшие приращения не увеличат долю связанного белка. Путем сравнения с набором стандартных разведений свободного зонда, проведенных на том же геле, можно рассчитать количество молей белка. [4]
К этой смеси можно добавить антитело, распознающее белок, чтобы создать еще больший комплекс с большим сдвигом. Этот метод называется анализом суперсдвига и используется для однозначной идентификации белка, присутствующего в комплексе белок-нуклеиновая кислота.
Часто дополнительная полоса запускается с конкурентным олигонуклеотидом для определения наиболее благоприятной последовательности связывания для связывающего белка. Использование различных олигонуклеотидов определенной последовательности позволяет идентифицировать точный сайт связывания путем конкуренции (не показано на схеме). Варианты конкурентного анализа полезны для измерения специфичности связывания и для измерения кинетики ассоциации и диссоциации. Таким образом, EMSA также может использоваться как часть эксперимента SELEX для выбора олигонуклеотидов, которые действительно связывают данный белок. [ необходима цитата ]
После определения связывания ДНК-белок in vitro ряд алгоритмов может сузить поиск для идентификации фактора транскрипции. Консенсусные последовательности олигонуклеотидов для интересующего фактора транскрипции смогут конкурировать за связывание, устраняя смещенную полосу, и должны быть подтверждены суперсдвигом. Если предсказанная консенсусная последовательность не может конкурировать за связывание, идентификация фактора транскрипции может быть поддержана Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), посредством чего большие наборы консенсусных последовательностей мультиплексируются в каждой реакции, и когда один набор конкурирует за связывание, отдельные консенсусные последовательности из этого набора запускаются в дальнейшей реакции. [7]
Для визуализации фрагмент нуклеиновой кислоты обычно метят радиоактивной , флуоресцентной или биотиновой меткой. Стандартное окрашивание бромистым этидием менее чувствительно, чем эти методы, и может не иметь чувствительности для обнаружения нуклеиновой кислоты, если в этих экспериментах используются небольшие количества нуклеиновой кислоты или одноцепочечной нуклеиновой кислоты(кислот). При использовании биотиновой метки для обнаружения фрагмента ДНК используется стрептавидин , конъюгированный с ферментом, таким как пероксидаза хрена. [8] [9] В то время как изотопная маркировка ДНК мало или совсем не влияет на аффинность связывания белка, использование неизотопных меток, включая флуорофоры или биотин, может изменить аффинность и/или стехиометрию интересующего взаимодействия белка. Конкуренция между зондом, меченым флуорофором или биотином, и немеченой ДНК той же последовательности может использоваться для определения того, изменяет ли метка аффинность связывания или стехиометрию.