stringtranslate.com

454 Науки о жизни

454 Life Sciences была биотехнологической компанией, базирующейся в Брэнфорде, штат Коннектикут, которая специализировалась на высокопроизводительном секвенировании ДНК . Она была приобретена Roche в 2007 году и закрыта Roche в 2013 году, когда ее технология стала неконкурентоспособной, хотя производство продолжалось до середины 2016 года. [1]

История

454 Life Sciences была основана Джонатаном Ротбергом [2] и изначально была известна как 454 Corporation, дочерняя компания CuraGen. За свой метод недорогого секвенирования генов 454 Life Sciences была награждена Золотой медалью Wall Street Journal за инновации в категории «Биотехнологии и медицина» в 2005 году. [3] Название 454 было кодовым названием, под которым проект именовался в CuraGen, и цифры не имеют известного особого значения. [4]

В ноябре 2006 года Ротберг, Майкл Эгхольм и коллеги из 454 опубликовали статью с заглавным текстом Сванте Паабо в журнале Nature , в которой описали первый миллион пар оснований генома неандертальца, и инициировали проект «Геном неандертальца», призванный завершить расшифровку генома неандертальца к 2009 году. [5]

В конце марта 2007 года Roche Diagnostics приобрела 454 Life Sciences за 154,9 млн долларов США. [6] Она осталась отдельным бизнес-подразделением. [7] В октябре 2013 года Roche объявила, что закроет 454 и прекратит поддержку платформы к середине 2016 года. [8]

В мае 2007 года 454 опубликовал результаты проекта «Джим»: секвенирование генома Джеймса Уотсона , соавтора открытия структуры ДНК. [9] [10]

Технологии

454 Секвенирование использовало крупномасштабную параллельную систему пиросеквенирования , способную секвенировать около 400-600 мегабаз ДНК за 10 часов работы на геномном секвенаторе FLX с реагентами серии GS FLX Titanium. [11]

Система основывалась на фиксации распыленных и лигированных адаптером фрагментов ДНК на небольших ДНК-захватывающих гранулах в эмульсии вода-в-масле . ДНК, фиксированная на этих гранулах, затем амплифицировалась с помощью ПЦР . Каждая связанная с ДНК гранула помещалась в лунку ~29 мкм на PicoTiterPlate , оптоволоконном чипе. Смесь ферментов , таких как ДНК-полимераза , АТФ-сульфурилаза и люцифераза , также помещалась в лунку. Затем PicoTiterPlate помещался в систему GS FLX для секвенирования.

454 выпустила секвенатор GS20 в 2005 году, первый ДНК-секвенатор следующего поколения на рынке. В 2008 году 454 Sequencing выпустила реагенты серии GS FLX Titanium для использования на инструменте Genome Sequencer FLX, с возможностью секвенирования 400-600 миллионов пар оснований за запуск с длиной прочтения 400-500 пар оснований. В конце 2009 года 454 Life Sciences представила GS Junior System, настольную версию Genome Sequencer FLX System. [12]

Подготовка библиотеки ДНК и эмПЦР

Геномная ДНК была фракционирована на более мелкие фрагменты (300-800 пар оснований) и отполирована (затуплена на каждом конце). Затем короткие адаптеры были лигированы на концы фрагментов. Эти адаптеры обеспечивали праймирующие последовательности как для амплификации, так и для секвенирования фрагментов библиотеки образцов. Один адаптер (адаптер B) содержал 5'- биотиновую метку для иммобилизации библиотеки ДНК на покрытых стрептавидином шариках. После исправления разрывов небиотинилированная цепь была освобождена и использована в качестве библиотеки одноцепочечной ДНК-матрицы (sstDNA). Библиотека sstDNA была оценена на предмет ее качества, и оптимальное количество (копий ДНК на шарик), необходимое для emPCR, определяется титрованием. [13]

Библиотека sstDNA была иммобилизована на бусах. Бусины, содержащие фрагмент библиотеки, несли одну молекулу sstDNA. Библиотека, связанная с бусинами, была эмульгирована с реагентами для амплификации в смеси вода-в-масле. Каждая бусина была захвачена в своем собственном микрореакторе, где происходит амплификация ПЦР. Это привело к иммобилизованным на бусах, клонально амплифицированным фрагментам ДНК.

Секвенирование

Бусины библиотеки ДНК с одноцепочечным шаблоном добавляли в смесь для инкубации ДНК-бусинок (содержащую ДНК-полимеразу) и наносили слоями с ферментными бусинами (содержащими сульфурилазу и люциферазу) на устройство PicoTiterPlate. Устройство центрифугировали для внесения бусин в лунки. Слой ферментных бусин обеспечивал то, что бусины ДНК оставались в лунках во время реакции секвенирования. Процесс внесения бусин был разработан для максимального увеличения числа лунок, содержащих одну амплифицированную библиотечную бусинку.

Загруженное устройство PicoTiterPlate было помещено в инструмент Genome Sequencer FLX. Подсистема струйной автоматики доставляла реагенты для секвенирования (содержащие буферы и нуклеотиды) через лунки планшета. Четыре нуклеотида ДНК добавлялись последовательно в фиксированном порядке через устройство PicoTiterPlate во время цикла секвенирования. Во время потока нуклеотидов миллионы копий ДНК, связанных с каждой из бусин, секвенировались параллельно. Когда нуклеотид, комплементарный шаблонной цепи, добавлялся в лунку, полимераза удлиняла существующую цепь ДНК, добавляя нуклеотид(ы). Добавление одного (или более) нуклеотида(ов) генерировало световой сигнал, который регистрировался ПЗС-камерой в инструменте. Эта техника была основана на секвенировании путем синтеза и называлась пиросеквенированием . [14] Сила сигнала была пропорциональна количеству нуклеотидов; например, гомополимерные участки, включенные в один поток нуклеотидов, генерировали больший сигнал, чем отдельные нуклеотиды. Однако сила сигнала для гомополимерных участков была линейной только до восьми последовательных нуклеотидов, после чего сигнал быстро падал. [15] Данные сохранялись в файлах стандартного формата флоуграмм (SFF) для последующего анализа.

Смотрите также

Примечания

  1. ^ Холлмер, Марк (17 октября 2013 г.). «Roche закрывает 454 Life Sciences, поскольку она снижает фокус на секвенировании генов». Fierce Biotech .
  2. ^ Парк, Андреа (15 февраля 2022 г.). «Quantum-Si выбирает основателя Ротберга, плодовитого предпринимателя в сфере медтехнологий, в качестве временного генерального директора». Fierce Biotech . Получено 22 февраля 2022 г.
  3. ↑ Тотти, Майкл (24 октября 2005 г.). «Лучшая идея». The Wall Street Journal . Архивировано из оригинала 30 сентября 2015 г. Получено 13 марта 2017 г.
  4. ^ Поллак, Эндрю (22 августа 2003 г.). «Компания заявляет, что картировала гены вируса за один день». The New York Times .
  5. ^ Грин, Ричард Э.; Краузе, Йоханнес; Птак, Сьюзан Э.; Бриггс, Адриан В.; Ронан, Майкл Т.; Саймонс, Ян Ф.; Ду, Лей; Эгхольм, Майкл; Ротберг, Джонатан М.; Паунович, Майя; Паабо, Сванте (ноябрь 2006 г.). «Анализ миллиона пар оснований неандертальской ДНК». Nature . 444 (7117): 330–336. Bibcode :2006Natur.444..330G. doi : 10.1038/nature05336 . PMID  17108958.
  6. ^ "Roche - Roche приобретает 454 Life Sciences для укрепления своего присутствия в области сверхбыстрого секвенирования генов". Архивировано из оригинала 29 августа 2012 г. Получено 14 ноября 2012 г.
  7. ^ "Roche заманивает в ловушку технологию секвенирования 454 в процессе выкупа". FierceBiotech . 28 марта 2007 г.
  8. ^ «После решения Roche закрыть 454 клиенты планируют перейти на другие платформы». 22 октября 2013 г.
  9. ^ Уилер, ДА; Шринивасан, М.; Эгхолм, М.; Шен, Ю.; Чен, Л.; Макгуайр, А.; Хе, В.; Чен, Ю.Дж.; Макхиджани, В.; Рот, ГТ; Гомес, Х.; Тартаро, К.; Ниази, Ф.; Теркотт, КЛ; Иржик, ГП; Лупски, Дж.Р.; Чинаулт, К.; Сонг, Х.-З.; Лю, Ю.; Юань, Ю.; Назарет, Л.; Цинь, Х.; Музни, ДМ; Маргулис, М.; Вайншток, ГМ; Гиббс, РА; Ротберг, Дж.М. (2008). «Полный геном человека с помощью массивного параллельного секвенирования ДНК». Nature . 452 (7189): 872–876. Bibcode : 2008Natur.452..872W. doi : 10.1038/nature06884 . PMID  18421352.
  10. ^ "Project Jim: Watson's Personal Genome Goes Public". Архивировано из оригинала 21 ноября 2008 г. Получено 16 июня 2007 г.
  11. ^ Карл, В. и др. (2009). «Секвенирование следующего поколения: от фундаментальных исследований до диагностики». Клиническая химия . 55 (4): 41–47. doi : 10.1373/clinchem.2008.112789 . PMID  19246620.
  12. ^ "454 Life Sciences представляет новый настольный секвенатор, значительные улучшения в системе геномного секвенатора FLX, включая считывания 1000 пар оснований в 2010 году" (пресс-релиз). 454 Life Sciences. 19 ноября 2009 г. Архивировано из оригинала 15 ноября 2011 г. Получено 19 ноября 2009 г.
  13. ^ Чжэн, З. и др. (2010). «Безтитрационное массивное параллельное пиросеквенирование с использованием следовых количеств исходного материала». Nucleic Acids Res . 38 (13): e137. doi : 10.1093/nar/gkq332. PMC 2910068. PMID  20435675. 
  14. ^ Кинг, К.; Скотт-Хортон, Т. (2008). «Пиросеквенирование: простой метод точного генотипирования». J Vis Exp (11). doi :10.3791/630. PMC 2582836 . PMID  19066560. 
  15. ^ Маргулис, Марсель; Майкл Эгхольм; 54 дополнительных соавтора (15 сентября 2005 г.). «Секвенирование генома в открытых микроизготовленных высокоплотных пиколитровых реакторах». Nature . 437 (7057). Nature Publishing Group: 376–380. Bibcode :2005Natur.437..376M. doi :10.1038/nature03959. PMC 1464427 . PMID  16056220. {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )