FLAG-тег , или FLAG-октапептид , или FLAG-эпитоп , представляет собой пептидный белковый тег , который может быть добавлен к белку с использованием технологии рекомбинантной ДНК , имеющий последовательность DYKDDDDK (где D = аспарагиновая кислота , Y = тирозин и K = лизин ). [1] Это один из самых специфичных тегов [2] и это искусственный антиген, к которому были разработаны специфические высокоаффинные моноклональные антитела, и, следовательно, его можно использовать для очистки белка с помощью аффинной хроматографии , а также для обнаружения белков в живых клетках. FLAG-тег использовался для отделения рекомбинантного , сверхэкспрессированного белка от дикого типа белка, экспрессируемого организмом-хозяином. FLAG-тег также может использоваться для выделения белковых комплексов с несколькими субъединицами, поскольку мягкая процедура очистки FLAG-тега, как правило, не разрушает такие комплексы. Очистка на основе FLAG-тегов использовалась для получения белков достаточной чистоты и качества для проведения трехмерного определения структуры методом рентгеновской кристаллографии .
FLAG-тег может использоваться во многих различных анализах , требующих распознавания антителом . Если антитела против данного белка отсутствуют, добавление FLAG-тега к белку позволяет изучать белок с помощью антитела против последовательности FLAG-тега. Примерами являются исследования клеточной локализации с помощью иммунофлуоресценции , иммунопреципитации или обнаружения с помощью электрофореза белков SDS PAGE и вестерн-блоттинга .
Пептидная последовательность FLAG-тега от N-конца до C-конца: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, FLAG-теги могут использоваться в тандеме, обычно пептид 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (с конечным тегом, кодирующим сайт расщепления энтерокиназой). FLAG-тег может быть слит с C-концом или N-концом белка или вставлен в белок. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1/4E11) распознают эпитоп только тогда, когда FLAG-тег присутствует на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, M2) нечувствительны к положению. Остаток тирозина в FLAG-теге может быть сульфатирован при экспрессии на определенных секретируемых белках, что может повлиять на распознавание антителами эпитопа FLAG. [3] Тег FLAG можно использовать вместе с другими тегами сродства, например, с полигистидиновым тегом ( His-тегом ), HA-тегом или myc-тегом .
Первое использование маркировки эпитопа было описано Манро и Пелхэмом в 1984 году. [4] FLAG-тег был вторым примером полностью функциональной, улучшенной эпитопной метки, опубликованной в научной литературе. [1] [5] [6] и был единственной эпитопной меткой, которая была запатентована. [7] [8] С тех пор он стал одной из наиболее часто используемых белковых меток в лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где моноклональное антитело сначала выделялось против существующего белка, затем эпитоп был охарактеризован и использовался в качестве метки, эпитоп FLAG был идеализированной искусственной конструкцией, к которой были получены моноклональные антитела. Последовательность FLAG-тега была оптимизирована для совместимости с белками, к которым он присоединен, в том смысле, что FLAG-тег более гидрофилен, чем другие распространенные эпитопные метки, и, следовательно, с меньшей вероятностью снижает активность белков, к которым присоединен FLAG-тег. Кроме того, N-концевые метки FLAG можно легко удалить из белков после их выделения путем обработки специфической протеазой, энтерокиназой ( энтеропептидазой ).
Третий отчет о маркировке эпитопа ( HA-tag ) [9] появился примерно через год после первой поставки системы Flag.
