Анизотропия флуоресценции

Анизотропия флуоресценции или поляризация флуоресценции — это явление, при котором свет, излучаемый флуорофором, имеет неравную интенсивность вдоль разных осей поляризации . Среди первых пионеров в этой области — Александр Яблонски , Грегорио Вебер [ ^1] и Андреас Альбрехт. ^[2] Принципы поляризации флуоресценции и некоторые применения метода представлены в книге Лаковича. ^[3]

Определение анизотропии флуоресценции

Анизотропия ( r) источника света определяется как отношение поляризованной составляющей к полной интенсивности ( ): ^[3] ${\displaystyle I_{T}}$

${\displaystyle r={\frac {I_{z}-I_{y}}{I_{x}+I_{y}+I_{z}}}}$

Когда возбуждение поляризовано вдоль оси z, излучение флуорофора симметрично вокруг оси z (рисунок). Следовательно, статистически мы имеем . Как и , мы имеем ${\displaystyle I_{x}=I_{y}}$ ${\displaystyle I_{y}=I_{\perp }}$ ${\displaystyle I_{z}=I_{\parallel }}$

${\displaystyle r={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{\parallel }+2I_{\perp }}}={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{T}}}}$.

Принцип – Броуновское движение и фотоселекция.

Броуновское движение наночастицы

При флуоресценции ^[4] молекула поглощает фотон и переходит в более высокое энергетическое состояние. После небольшой задержки (среднее значение представлено как время жизни флуоресценции ) он переходит в более низкое состояние, теряя часть энергии в виде тепла и излучая остальную часть энергии в виде другого фотона. Возбуждение и девозбуждение связаны с перераспределением электронов вокруг молекулы . Следовательно, возбуждение фотоном может произойти только в том случае, если электрическое поле света ориентировано по определенной оси вокруг молекулы. Кроме того, испускаемый фотон будет иметь специфическую поляризацию по отношению к молекуле. ${\displaystyle \tau }$

Первой концепцией измерения анизотропии, которую необходимо понять, является концепция броуновского движения . Хотя вода при комнатной температуре, содержащаяся в стакане, может показаться глазу очень неподвижной, на молекулярном уровне каждая молекула воды обладает кинетической энергией, и поэтому за любой промежуток времени между молекулами воды происходит множество столкновений. Наночастица (желтая точка на рисунке), взвешенная в растворе, будет совершать случайное блуждание из-за суммирования этих основных столкновений. Время корреляции вращения ( Φ _r ), время, необходимое молекуле для вращения на 1 радиан, зависит от вязкости ( η ), температуры (T), постоянной Больцмана ( k _B ) и объема ( V ) наночастицы: ^[5]

${\displaystyle \phi _{r}={{\eta V} \over {k{_{B}}T}}}$

Вторая концепция — фотоселекция с использованием поляризованного света. Когда поляризованный свет воздействует на группу случайно ориентированных флуорофоров, большинство возбужденных молекул будут ориентированы в определенном диапазоне углов к приложенной поляризации. Если они не двигаются, излучаемый свет также будет поляризован в определенном диапазоне углов по отношению к приложенному свету.

Для однофотонного возбуждения собственная анизотропия r ₀ имеет максимальное теоретическое значение 0,4, когда диполи возбуждения и излучения параллельны, и минимальное значение -0,2, когда диполи возбуждения и излучения перпендикулярны.

${\displaystyle {r_{0}}={2 \over 5}\left({{3{{\cos }^{2}}\beta -1} \over 2}\right)}$

где β — угол между диполями возбуждения и эмиссии. Для измерений стационарной флуоресценции ее обычно измеряют путем помещения флуорофора в замороженный полиол .

Возьмем простейший идеалистический случай: подмножество молекул красителя, суспендированных в растворе, которые имеют моноэкспоненциальное время жизни флуоресценции и r ₀ =0,4 (родамин 6g в этиленгликоле, имеющий поглощение ~0,05, является хорошим испытательным образцом). Если возбуждение неполяризовано, то измеренное излучение флуоресценции также должно быть неполяризованным. Однако если источник возбуждения вертикально поляризован с помощью поляризатора возбуждения, то в измеренной флуоресценции будут обнаружены эффекты поляризации. С этими артефактами поляризации можно бороться, разместив поляризатор излучения под магическим углом 54,7°. Если поляризатор излучения вертикально поляризован, произойдет дополнительная потеря флуоресценции, поскольку броуновское движение приводит к перемещению молекул красителя из исходной вертикально поляризованной конфигурации в неполяризованную конфигурацию. С другой стороны, если поляризатор излучения горизонтально поляризован, произойдет дополнительное введение возбужденных молекул, которые изначально были поляризованы вертикально и стали деполяризованными в результате броуновского движения. Сумма и разность флуоресценции могут быть построены путем сложения интенсивностей и вычитания интенсивностей флуоресценции соответственно: ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle S={I_{VV}}+2G{I_{VH}}}$

${\displaystyle D={I_{VV}}-G{I_{VH}}}$

Разделив разницу на сумму, получим затухание анизотропии:

${\displaystyle r={D \over S}}$

Коэффициент решетки G представляет собой инструментальное предпочтение эмиссионной оптики горизонтальной ориентации по сравнению с вертикальной. Его можно измерить, переместив поляризатор возбуждения в горизонтальное положение и сравнив интенсивности, когда поляризатор излучения вертикально и горизонтально поляризован соответственно.

${\displaystyle G={{I_{HV}} \over {I_{HH}}}}$

G зависит от длины волны излучения. Примечание. G в литературе определяется как показано обратное.

Степень декорреляции поляризации падающего и испускаемого света зависит от того, насколько быстро меняется ориентация флуорофора (вращательное время жизни ) по сравнению со временем жизни флуоресценции ( ). Перемешивание ориентаций может происходить за счет переворота всей молекулы или за счет вращения только флуоресцентной части. Скорость переворачивания связана с измеренной анизотропией уравнением Перрена: ${\displaystyle \phi }$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle r(\tau )={\frac {r_{0}}{1+\tau /\tau _{c}}}}$

где r — наблюдаемая анизотропия, r ₀ — собственная анизотропия молекулы, время жизни флуоресценции и время корреляции вращения. ^[6] ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau _{c}}$

Этот анализ действителен только в том случае, если флуорофоры расположены относительно далеко друг от друга. Если они находятся очень близко друг к другу, они могут обмениваться энергией посредством FRET , а поскольку излучение может происходить от одной из многих независимо движущихся (или ориентированных) молекул, это приводит к более низкой, чем ожидалось, анизотропии или большей декорреляции. Этот тип гомопереноса резонансной передачи энергии Фёрстера называется миграцией энергии FRET или emFRET .

Стационарная анизотропия флуоресценции дает только «среднюю» анизотропию. Гораздо больше информации можно получить с помощью анизотропии флуоресценции с временным разрешением ^[7] , где время затухания, остаточная анизотропия и время вращательной корреляции могут быть определены путем аппроксимации затухания анизотропии. Обычно для возбуждения используется лазерный источник с вертикальными импульсами, а между пусковыми импульсами лазера (старт) и измерением фотонов флуоресценции (стоп) добавляется электроника синхронизации. Обычно используется метод подсчета одиночных фотонов с корреляцией по времени (TCSPC).

Опять же, используя идеалистический простейший случай, подмножество молекул красителя, суспендированных в растворе, имеют моноэкспоненциальное время жизни флуоресценции и начальную анизотропию r ₀ =0,4. Если образец возбуждается импульсным вертикально ориентированным источником возбуждения, то следует измерить одно время затухания, когда поляризатор излучения находится под магическим углом. Если поляризатор излучения имеет вертикальную поляризацию, вместо этого будут измерены два времени затухания, оба с положительными предэкспоненциальными коэффициентами, первое время затухания должно быть эквивалентно измеренному с помощью установки неполяризованного излучения, а второе время затухания будет связано с потерей флуоресценция как броуновское движение приводит к тому, что молекулы красителя переходят из исходной вертикально поляризованной конфигурации в неполяризованную конфигурацию. С другой стороны, если поляризатор излучения горизонтально поляризован, два времени затухания снова будут восстановлены: первое с положительным предэкспоненциальным коэффициентом и будет эквивалентно, а второе будет иметь отрицательный предэкспоненциальный коэффициент, возникающий из-за введение возбужденных молекул, которые изначально были поляризованы вертикально, а затем деполяризовались в результате броуновского движения. Сумма и разность флуоресценции могут быть построены путем сложения затухания и вычитания затухания флуоресценции соответственно: ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle S(t)=G{I_{VV}}(t)+2{I_{VH}}(t)}$

${\displaystyle D(t)=G{I_{VV}}(t)-{I_{VH}}(t)}$

Разделив разницу на сумму, получим затухание анизотропии:

${\displaystyle r(t)={D(t) \over S(t)}}$

В простейшем случае только для одного вида сферического красителя:

${\displaystyle r(t)={r_{0}}\exp \left({-{t \over {\phi _{r}}}}\right)}$

Приложения

Анизотропию флуоресценции можно использовать для измерения констант связывания и кинетики реакций, вызывающих изменение времени вращения молекул. Если флуорофор представляет собой небольшую молекулу, скорость его падения может значительно снизиться, когда он связан с большим белком. Если флуорофор прикреплен к более крупному белку в связывающей паре, разница в поляризации между связанным и несвязанным состояниями будет меньше (поскольку несвязанный белок уже будет достаточно стабильным и вначале будет медленно падать), и измерение будет менее точным. . Степень связывания рассчитывается с использованием разницы в анизотропии частично связанного, свободного и полностью связанного (большой избыток белка) состояний, измеренной путем титрования двух партнеров связывания.

Если флуорофор связан с относительно большой молекулой, такой как белок или РНК, изменение подвижности, сопровождающее сворачивание, можно использовать для изучения динамики сворачивания. Это позволяет оценить динамику того, как белок достигает своей окончательной, стабильной трехмерной формы. В сочетании с флуорофорами, которые взаимодействуют посредством резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET), анизотропию флуоресценции можно использовать для обнаружения олигомерного состояния комплексообразующих молекул ( «Сколько молекул взаимодействуют?» ). ^[8]

Анизотропия флуоресценции также применяется в микроскопии с использованием поляризаторов на пути освещающего света, а также перед камерой. Это можно использовать для изучения локальной вязкости цитозоля или мембран, причем последняя дает информацию о микроструктуре мембраны и относительных концентрациях различных липидов. Этот метод также использовался для обнаружения связывания молекул со своими партнерами в сигнальных каскадах в ответ на определенные сигналы.

Феномен emFRET и связанное с ним снижение анизотропии при возникновении тесных взаимодействий между флуорофорами было использовано для изучения агрегации белков в ответ на передачу сигналов.

Смотрите также

• Резонансная передача энергии Фёрстера (FRET)
  • Резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET)
• Магнитная анизотропия
• Факторы трения Перрина

Рекомендации

1. Вебер, Г., 1953. Вращательное броуновское движение и поляризация флуоресценции растворов. Адв. Белковая хим. 8:415-459
2. Альбрехт, А., 1961. Поляризации и назначения переходов: метод фотоселекции. Дж. Мол. Спектроск. 6:84-108.
3. Lakowicz, JR, 2006. Принципы флуоресцентной спектроскопии (3-е изд., Springer. Главы 10-12 посвящены поляризационной спектроскопии флуоресценции).
4. Миллер, Дж. Н., изд. (1981). Стандарты флуоресцентной спектрометрии - Ультрафиолетовая спектрометрия | Дж. Миллер | Спрингер. Методы видимой и ультрафиолетовой спектрометрии. Спрингер. дои : 10.1007/978-94-009-5902-6. ISBN 9789400959040. Проверено 16 января 2016 г.
5. Берч, Дэвид Дж.С.; Йип, Филип (01 января 2014 г.). «Нанометрология» (PDF) . В Энгельборге, Ив; Виссер, Антони JWG (ред.). Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия . Методы молекулярной биологии. Том. 1076. Хумана Пресс . стр. 279–302. дои : 10.1007/978-1-62703-649-8_11. ISBN 978-1-62703-648-1. ПМИД  24108630.
6. Валёр, Бернар. 2001. Молекулярная флуоресценция: принципы и применение Wiley-VCH, стр.29.
7. Берч, Дэвид Дж.С.; Имхоф, Роберт Э. (1 января 2002 г.). «Флуоресцентная спектроскопия во временной области с использованием коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов». В Лаковиче, Джозеф Р. (ред.). Темы флуоресцентной спектроскопии . Том. 1. Спрингер США . стр. 1–95. дои : 10.1007/0-306-47057-8_1. ISBN 978-0-306-43874-5.
8. Хекмайер, Филипп Дж.; Агам, Ганеша; Тиз, Марк Г.; Хойер, Мария; Штеле, Ральф; Лэмб, Дон К.; Лангош, Дитер (июль 2020 г.). «Определение стехиометрии малых белковых олигомеров с использованием стационарной анизотропии флуоресценции». Биофизический журнал . 119 (1): 99–114. дои : 10.1016/j.bpj.2020.05.025 . ПМЦ 7335908 .