Мультиплексная лигированно-зависимая амплификация зонда ( MLPA ) — это разновидность мультиплексной полимеразной цепной реакции , которая позволяет амплифицировать несколько целей с помощью только одной пары праймеров . [1] Она обнаруживает изменения числа копий на молекулярном уровне, а для анализа используются программы. Идентификация делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии по всему миру.
Мультиплексная лигированно-зависимая амплификация зонда была изобретена Яном Схоутеном , голландским ученым. [1] Метод был впервые описан в 2002 году в научном журнале Nucleic Acid Research . [2] Первые приложения включали обнаружение делеций экзонов в человеческих генах BRCA1 , MSH2 и MLH1 , которые связаны с наследственным раком груди и толстой кишки. Теперь MLPA используется для обнаружения сотен наследственных заболеваний, а также для профилирования опухолей.
MLPA количественно определяет наличие определенных последовательностей в образце ДНК, используя специально разработанную пару зондов для каждой целевой последовательности, представляющей интерес. Процесс состоит из нескольких этапов: [3]
Каждая пара зондов состоит из двух олигонуклеотидов с последовательностью, которая распознает соседние участки целевой ДНК , сайтом праймирования ПЦР и, необязательно, «наполнителем», чтобы придать продукту ПЦР уникальную длину по сравнению с другими парами зондов в анализе MLPA. Каждая полная пара зондов должна иметь уникальную длину, чтобы ее полученные ампликоны могли быть однозначно идентифицированы во время количественной оценки, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР . Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, флуоресцентно помечен, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который может быть обнаружен капиллярным секвенатором. Сравнивая пиковую картину, полученную на данном образце, с полученной на различных контрольных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой соотношения, в котором целевая последовательность присутствует в образце ДНК.
Различные методы, включая DGGE ( денатурирующий градиентный гель-электрофорез ), DHPLC ( денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография ) и SSCA (анализ конформации одноцепочечной ДНК), эффективно идентифицируют SNP и небольшие вставки и делеции. Однако MLPA является одним из немногих точных и экономичных по времени методов обнаружения геномных делеций и вставок (одного или нескольких целых экзонов), которые часто являются причинами таких видов рака, как наследственный неполипозный колоректальный рак ( HNPCC ), рак молочной железы и рак яичников. MLPA может успешно и легко определить относительное число копий всех экзонов в гене одновременно с высокой чувствительностью.
Важным применением MLPA является определение относительной плоидности . Например, зонды могут быть разработаны для нацеливания на различные регионы хромосомы 21 человеческой клетки. Силы сигналов зондов сравниваются с сигналами, полученными из контрольного образца ДНК, о котором известно, что он имеет две копии хромосомы. Если в тестовом образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза больше интенсивности соответствующих зондов из эталона. Если присутствует только одна копия, ожидается, что пропорция составит 0,5. Если в образце есть две копии, ожидается, что относительные силы зондов будут равны.
Анализ коэффициента дозировки является обычным методом интерпретации данных MLPA. [4] Если a и b являются сигналами от двух ампликонов в образце пациента, а A и B являются соответствующими ампликонами в экспериментальном контроле, то коэффициент дозировки DQ = (a/b) / (A/B). Хотя коэффициенты дозировки могут быть рассчитаны для любой пары ампликонов, обычно один из пары является внутренним референтным зондом.
MLPA облегчает амплификацию и обнаружение нескольких целей с помощью одной пары праймеров. В стандартной мультиплексной реакции ПЦР каждому фрагменту требуется уникальная пара праймеров для амплификации. Эти праймеры, присутствующие в большом количестве, приводят к различным проблемам, таким как димеризация и ложное праймирование. С помощью MLPA можно добиться амплификации зондов. Таким образом, многие последовательности (до 40) можно амплифицировать и количественно оценить с помощью всего одной пары праймеров. Реакция MLPA быстрая, недорогая и очень простая в исполнении.
MLPA имеет множество применений [5] , включая обнаружение мутаций и полиморфизмов отдельных нуклеотидов , [6] анализ метилирования ДНК , [7] относительную количественную оценку мРНК , [8] хромосомную характеристику линий клеток и образцов тканей, [9] обнаружение числа копий генов, [10] обнаружение дупликаций и делеций в генах предрасположенности к раку человека, таких как BRCA1 , BRCA2 , hMLH1 и hMSH2 [11] и определение анеуплоидии . [12] MLPA имеет потенциальное применение в пренатальной диагностике как инвазивной [13] , так и неинвазивной . [14]
Недавние исследования показали, что MLPA (а также другие варианты, такие как iMLPA) является надежным методом для характеристики инверсии. [15]
Giner-Delgado, Carla и др. описали вариант MLPA, объединяющий его с iPCR. Они называют этот новый метод iMLPA [15] , и его процедура такая же, как и MLPA, но в начале необходимо два дополнительных шага:
Конструкция зонда довольно похожа. Каждый зонд будет образован двумя частями, которые имеют по крайней мере: целевую последовательность , которая представляет собой область, содержащую последовательность, комплементарную интересующей области, так что может произойти правильная гибридизация. И последовательность праймера в конце, это последовательность, конструкция которой варьируется, и это то, что позволит проектировать праймеры и последующую амплификацию фрагмента. Кроме того, одна из частей зонда обычно содержит наполнитель между целевой последовательностью и последовательностью праймера. Использование различных наполнителей позволяет идентифицировать зонды с одинаковыми последовательностями праймера, но разными целевыми последовательностями, что является ключевым для многократной амплификации нескольких различных фрагментов в одной реакции.
Следующий шаг продолжается с типичным протоколом MLPA. [1]
