stringtranslate.com

Мутагенез (метод молекулярной биологии)

Типы мутаций, которые могут быть введены посредством случайного, сайт-направленного, комбинаторного или инсерционного мутагенеза.

В молекулярной биологии мутагенез является важным лабораторным методом, посредством которого мутации ДНК намеренно конструируются для получения библиотек мутантных генов, белков, штаммов бактерий или других генетически модифицированных организмов . Различные компоненты гена, а также его регуляторные элементы и его генные продукты могут быть мутированы, так что функционирование генетического локуса, процесса или продукта может быть подробно изучено. Мутация может производить мутантные белки с интересными свойствами или улучшенными или новыми функциями, которые могут иметь коммерческое использование. Также могут быть получены мутантные штаммы, которые имеют практическое применение или позволяют исследовать молекулярную основу определенной функции клетки.

Сегодня существует множество методов мутагенеза. Первоначально мутации, искусственно вызванные в лаборатории, были полностью случайными с использованием таких механизмов, как УФ-облучение. Случайный мутагенез не может быть нацелен на определенные области или последовательности генома; однако с развитием сайт-направленного мутагенеза можно вносить более специфические изменения. С 2013 года разработка технологии CRISPR /Cas9, основанной на системе защиты прокариотических вирусов, позволила редактировать или мутагенез генома in vivo . [1] Сайт-направленный мутагенез оказался полезным в ситуациях, когда случайный мутагенез не является таковым. Другие методы мутагенеза включают комбинаторный и инсерционный мутагенез. Мутагенез, который не является случайным, может быть использован для клонирования ДНК, [2] исследования эффектов мутагенов, [3] и конструирования белков. [4] Он также имеет медицинские применения, такие как помощь пациентам с ослабленным иммунитетом, исследование и лечение заболеваний, включая ВИЧ и рак, и излечение таких заболеваний, как бета-талассемия . [5]

Случайный мутагенез

Как библиотеки ДНК генерируются случайным мутагенезом, выборочное пространство последовательностей. Показана аминокислота, замещенная в заданной позиции. Каждая точка или набор связанных точек является одним членом библиотеки. Подверженная ошибкам ПЦР случайным образом мутирует некоторые остатки в другие аминокислоты. Сканирование аланина заменяет каждый остаток белка аланином, один за другим. Насыщение сайтов заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторое их подмножество) в одной позиции, один за другим.

Ранние подходы к мутагенезу основывались на методах, которые производили полностью случайные мутации. В таких методах клетки или организмы подвергаются воздействию мутагенов, таких как УФ-излучение или мутагенные химикаты, а затем отбираются мутанты с желаемыми характеристиками. Герман Мюллер открыл в 1927 году, что рентгеновские лучи могут вызывать генетические мутации у плодовых мушек , [6] и продолжил использовать созданных им мутантов для своих исследований в области генетики . [7] Для Escherichia coli мутанты могут быть отобраны сначала путем воздействия УФ-излучения, а затем высеяны на агаровую среду. Образованные колонии затем высеваются репликами , одна в богатую среду , другая в минимальную среду, и мутанты, которые имеют особые потребности в питании, затем могут быть идентифицированы по их неспособности расти в минимальной среде. Аналогичные процедуры могут быть повторены с другими типами клеток и с различными средами для отбора.

Позднее был разработан ряд методов генерации случайных мутаций в определенных белках для скрининга мутантов с интересными или улучшенными свойствами. Эти методы могут включать использование легированных нуклеотидов в синтезе олигонуклеотидов или проведение реакции ПЦР в условиях, которые усиливают неправильное включение нуклеотидов (ПЦР, подверженная ошибкам), например, путем снижения точности репликации или использования аналогов нуклеотидов. [8] Разновидностью этого метода для интеграции несмещенных мутаций в ген является мутагенез с насыщением последовательностей . [9] Продукты ПЦР, которые содержат мутацию(и), затем клонируются в вектор экспрессии , и полученные мутантные белки затем могут быть охарактеризованы.

В исследованиях на животных алкилирующие агенты , такие как N -этил- N -нитрозомочевина (ENU), использовались для создания мутантных мышей. [10] [11] Этилметансульфонат (EMS) также часто используется для создания мутантов животных, растений и вирусов. [12] [13] [14]

В законе Европейского Союза (в виде директивы 2001/18) этот вид мутагенеза может использоваться для производства ГМО , но продукты освобождены от регулирования: нет маркировки, нет оценки. [15]

Сайт-направленный мутагенез

До разработки методов сайт-направленного мутагенеза все мутации были случайными, и ученым приходилось использовать отбор для желаемого фенотипа, чтобы найти нужную мутацию. Методы случайного мутагенеза имеют преимущество с точки зрения того, сколько мутаций может быть произведено; однако, хотя случайный мутагенез может производить изменение в отдельных нуклеотидах, он не обеспечивает особого контроля над тем, какой нуклеотид изменяется. [5] Поэтому многие исследователи стремятся вводить выбранные изменения в ДНК точным, сайт-специфическим образом. Ранние попытки использовали аналоги нуклеотидов и других химических веществ, которые впервые использовались для создания локализованных точечных мутаций . [16] К таким химическим веществам относятся аминопурин , который вызывает переход AT в GC , [17] в то время как нитрозогуанидин , [18] бисульфит , [19] и N 4 -гидроксицитидин могут вызывать переход GC в AT. [20] [21] Эти методы позволяют встраивать определенные мутации в белок; Однако они не являются гибкими в отношении видов генерируемых мутантов, и не являются такими специфичными, как более поздние методы направленного мутагенеза, и поэтому имеют некоторую степень случайности. Другие технологии, такие как расщепление ДНК в определенных местах на хромосоме, добавление новых нуклеотидов и обмен парами оснований, теперь позволяют решать, куда могут пойти мутации. [11] [8]

Упрощенная схема метода направленного мутагенеза с использованием готовых олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с ДНК-полимеразой

Современные методы сайт-специфической мутации берут начало от метода удлинения праймера, разработанного в 1978 году. Такие методы обычно включают использование предварительно изготовленных мутагенных олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с ДНК-полимеразой . Эти методы позволяют проводить точечную мутацию или делецию или вставку небольших участков ДНК в определенных местах. Достижения в методологии сделали такой мутагенез теперь относительно простым и эффективным процессом. [3]

Постоянно разрабатываются новые и более эффективные методы направленного мутагенеза. Например, метод, называемый «Seamless ligation cloning extract» (или SLiCE для краткости), позволяет клонировать определенные последовательности ДНК в геноме, и в геном можно вставить более одного фрагмента ДНК одновременно. [2]

Сайт-направленный мутагенез позволяет исследовать эффект конкретной мутации. Существует множество применений; например, он использовался для определения того, насколько восприимчивы определенные виды к химикатам, которые часто используются в лабораториях. Эксперимент использовал сайт-направленный мутагенез для имитации ожидаемых мутаций конкретного химиката. Мутация привела к изменению определенных аминокислот, и были проанализированы эффекты этой мутации. [3]

Мутагенез с насыщением сайта — это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез с насыщением одной позиции в теоретическом белке из 10 остатков. Версия дикого типа белка показана вверху, где M представляет первую аминокислоту метионин, а * представляет собой прекращение трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в позиции 5 показаны ниже.

Сайт-направленный подход может быть реализован систематически в таких методах, как сканирующий мутагенез аланина , при котором остатки систематически мутируют в аланин с целью идентификации остатков, важных для структуры или функции белка. [22] Другим комплексным подходом является сайт -насыщающий мутагенез , при котором один кодон или набор кодонов могут быть заменены всеми возможными аминокислотами в определенных положениях. [23] [24]

Комбинаторный мутагенез

Комбинаторный мутагенез — это метод сайт-направленной белковой инженерии, при котором несколько мутантов белка могут быть одновременно сконструированы на основе анализа эффектов дополнительных индивидуальных мутаций. [25] Он обеспечивает полезный метод оценки комбинаторного эффекта большого количества мутаций на функцию белка. [26] Большое количество мутантов может быть проверено на определенную характеристику с помощью комбинаторного анализа. [25] В этом методе несколько позиций или коротких последовательностей вдоль цепи ДНК могут быть исчерпывающе изменены для получения всеобъемлющей библиотеки мутантных белков. [25] Скорость возникновения полезных вариантов может быть улучшена различными методами построения библиотек мутагенеза. Один из подходов к этому методу заключается в извлечении и замене части последовательности ДНК библиотекой последовательностей, содержащей все возможные комбинации в желаемом сайте мутации. Содержание вставленного сегмента может включать последовательности структурного значения, иммуногенные свойства или ферментативную функцию. Сегмент также может быть вставлен случайным образом в ген для оценки структурного или функционального значения определенной части белка. [25]

Инсерционный мутагенез

Вставка одной или нескольких пар оснований, приводящая к мутациям ДНК, также известна как инсерционный мутагенез . [27] Такие сконструированные мутации могут предоставить важную информацию в исследованиях рака, например, механистическое понимание развития заболевания. Ретровирусы и транспозоны являются главными инструментами в инсерционном мутагенезе. Ретровирусы, такие как вирус опухоли молочной железы у мышей и вирус лейкемии у мышей, могут использоваться для идентификации генов, участвующих в канцерогенезе, и понимания биологических путей конкретных видов рака. [28] Транспозоны, хромосомные сегменты, которые могут подвергаться транспозиции, могут быть разработаны и применены к инсерционному мутагенезу в качестве инструмента для обнаружения генов рака. [28] Эти хромосомные сегменты позволяют применять инсерционный мутагенез практически к любой ткани по выбору, а также обеспечивают более полную, беспристрастную глубину в секвенировании ДНК. [28]

Исследователи обнаружили четыре механизма инсерционного мутагенеза, которые можно использовать на людях. Первый механизм называется инсерционной инсерцией. Энхансеры усиливают транскрипцию определенного гена, взаимодействуя с промотором этого гена. Этот конкретный механизм был впервые использован для оказания помощи пациентам с тяжелым иммунодефицитом, которым мне нужен костный мозг. Затем пациентам были введены гаммаретровирусы, несущие энхансеры. Второй механизм называется инсерционной инсерцией. Промоторы предоставляют нашим клеткам определенные последовательности, необходимые для начала трансляции. Инсерционная инсерция помогла исследователям узнать больше о вирусе ВИЧ. Третий механизм — инактивация генов. Примером инактивации генов является использование инсерционного мутагенеза для вставки ретровируса, который нарушает геном Т-клетки у пациентов с лейкемией и дает им определенный антиген, называемый CAR, позволяющий Т-клеткам нацеливаться на раковые клетки. Последний механизм называется заменой 3'-конца мРНК. Наши гены иногда подвергаются точечным мутациям, вызывающим бета-талассемию, которая нарушает функцию эритроцитов. Чтобы решить эту проблему, вводят правильную последовательность генов для эритроцитов и производят замену. [5]

Гомологичная рекомбинация

Гомологичная рекомбинация может быть использована для создания определенной мутации в организме. Вектор, содержащий последовательность ДНК, похожую на ген, который должен быть модифицирован, вводится в клетку и посредством процесса рекомбинации заменяет целевой ген в хромосоме. Этот метод может быть использован для введения мутации или нокаута гена, например, как это используется при производстве нокаутированных мышей . [29]

КРИСПР

С 2013 года развитие технологии CRISPR -Cas9 позволило эффективно вводить различные типы мутаций в геном самых разных организмов. Метод не требует места вставки транспозона, не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом редактирования генома . [30] [31]

Синтез генов

Поскольку стоимость синтеза олигонуклеотидов ДНК падает, искусственный синтез полного гена теперь является жизнеспособным методом введения мутаций в ген. Этот метод позволяет проводить обширные мутации в нескольких местах, включая полную переделку использования кодонов гена для его оптимизации для конкретного организма. [32]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для генной инженерии». Cell . 157 (6): 1262–78. doi :10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC  4343198 . PMID  24906146.
  2. ^ ab Motohashi K (июнь 2015 г.). «Простой и эффективный метод бесшовного клонирования ДНК с использованием SLiCE из лабораторных штаммов Escherichia coli и его применение к направленному мутагенезу SLiP». BMC Biotechnology . 15 : 47. doi : 10.1186/s12896-015-0162-8 . PMC 4453199 . PMID  26037246. 
  3. ^ abc Doering JA, Lee S, Kristiansen K, Evenseth L, Barron MG, Sylte I, LaLone CA (ноябрь 2018 г.). «In silico Site-Directed Mutagenesis Informs Species-Specific Predictions of Chemical Susceptibility Derived From the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) Tool». Токсикологические науки . 166 (1): 131–145. doi :10.1093/toxsci/kfy186. PMC 6390969 . PMID  30060110. 
  4. ^ Choi GC, Zhou P, Yuen CT, Chan BK, Xu F, Bao S и др. (август 2019 г.). «Комбинаторный мутагенез в массе оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Nature Methods . 16 (8): 722–730. doi :10.1038/s41592-019-0473-0. PMID  31308554. S2CID  196811756.
  5. ^ abc Bushman FD (февраль 2020 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез у людей: доказательства четырех генетических механизмов, способствующих расширению клеточных клонов». Молекулярная терапия . 28 (2): 352–356. doi :10.1016/j.ymthe.2019.12.009. PMC 7001082. PMID  31951833 . 
  6. ^ Muller HJ (июль 1927). «Искусственная трансмутация гена» (PDF) . Science . 66 (1699): 84–7. Bibcode : 1927Sci....66...84M. doi : 10.1126/science.66.1699.84. PMID  17802387.
  7. ^ Кроу Дж. Ф., Абрахамсон С. (декабрь 1997 г.). «Семьдесят лет назад: мутация становится экспериментальной». Генетика . 147 (4): 1491–6. doi :10.1093/genetics/147.4.1491. PMC 1208325. PMID  9409815 . 
  8. ^ ab Blackburn GM, ed. (2006). Нуклеиновые кислоты в химии и биологии (3-е изд.). Королевское химическое общество. стр. 191–192. ISBN 978-0854046546.
  9. ^ Wong TS, Tee KL, Hauer B, Schwaneberg U (февраль 2004 г.). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции». Nucleic Acids Research . 32 (3): 26e–26. doi :10.1093/nar/gnh028. PMC 373423. PMID  14872057 . 
  10. ^ Джастис М.Дж., Новероске Дж.К., Вебер Дж.С., Чжэн Б., Брэдли А. (1999). «Мутагенез мыши ENU». Молекулярная генетика человека . 8 (10): 1955–63. doi : 10.1093/hmg/8.10.1955 . PMID  10469849.
  11. ^ ab Hrabé de Angelis M, Balling R (май 1998). "Масштабные скрининги ENU у мышей: генетика встречается с геномикой". Mutation Research . 400 (1–2): 25–32. Bibcode : 1998MRFMM.400...25D. doi : 10.1016/s0027-5107(98)00061-x. PMID  9685575.
  12. ^ Flibotte S, Edgley ML, Chaudhry I, Taylor J, Neil SE, Rogula A и др. (июнь 2010 г.). «Полногеномное профилирование мутагенеза у Caenorhabditis elegans». Genetics . 185 (2): 431–41. doi :10.1534/genetics.110.116616. PMC 2881127 . PMID  20439774. 
  13. ^ Bökel C (2008). "EMS Screens: From Mutagenesis to Screening and Mapping". Drosophila . Methods in Molecular Biology. Vol. 420. pp. 119–38. doi :10.1007/978-1-59745-583-1_7. ISBN 978-1-58829-817-1. PMID  18641944.
  14. ^ Favor AH, Llanos CD, Youngblut MD, Bardales JA (2020). «Оптимизация инженерии бактериофагов с помощью платформы ускоренной эволюции». Scientific Reports . 10 (1): 13981. doi :10.1038/s41598-020-70841-1. PMC 7438504. PMID  32814789. 
  15. ^ Кринке С (март 2018 г.). «Директива о ГМО: истоки исключения мутагенеза». Inf'OGM .
  16. ^ Shortle D, DiMaio D, Nathans D (1981). «Направленный мутагенез». Annual Review of Genetics . 15 : 265–94. doi :10.1146/annurev.ge.15.120181.001405. PMID  6279018.
  17. ^ Карас И.В., Макиннес М.А., Персинг Д.Х., Коффино П., Мартин Д.В. (сентябрь 1982 г.). «Механизм мутагенеза 2-аминопурина в клетках Т-лимфосаркомы мыши». Молекулярная и клеточная биология . 2 (9): 1096–103. дои : 10.1128/mcb.2.9.1096. ПМК 369902 . ПМИД  6983647. 
  18. ^ McHugh GL, Miller CG (октябрь 1974 г.). «Выделение и характеристика мутантов пролинпептидазы Salmonella typhimurium». Журнал бактериологии . 120 (1): 364–71. doi :10.1128/JB.120.1.364-371.1974. PMC 245771. PMID  4607625 . 
  19. ^ Shortle D, Nathans D (май 1978). «Локальный мутагенез: метод создания вирусных мутантов с заменами оснований в предварительно выбранных областях вирусного генома». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (5): 2170–4. Bibcode :1978PNAS...75.2170S. doi : 10.1073/pnas.75.5.2170 . PMC 392513 . PMID  209457. 
  20. ^ Flavell RA, Sabo DL, Bandle EF, Weissmann C (январь 1975 г.). «Сайт-направленный мутагенез: влияние внецистронной мутации на in vitro распространение РНК бактериофага Qbeta». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (1): 367–71. Bibcode : 1975PNAS...72..367F. doi : 10.1073/pnas.72.1.367 . PMC 432306. PMID  47176 . 
  21. ^ Мюллер В., Вебер Х., Мейер Ф., Вайсман К. (сентябрь 1978 г.). «Сайт-направленный мутагенез в ДНК: генерация точечных мутаций в клонированной бета-глобиновой комплементарной ДНК в положениях, соответствующих аминокислотам 121–123». Журнал молекулярной биологии . 124 (2): 343–58. doi :10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID  712841.
  22. ^ Ванесса Э. Грей; Рональд Дж. Хауз; Дуглас М. Фаулер (1 сентября 2017 г.). «Анализ данных крупномасштабного мутагенеза для оценки влияния замен отдельных аминокислот». Генетика . 207 (1): 53–61. doi :10.1534/genetics.117.300064. PMC 5586385. PMID  28751422 . 
  23. ^ Reetz, MT; Carballeira JD (2007). «Итеративный насыщающий мутагенез (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Nature Protocols . 2 (4): 891–903. doi :10.1038/nprot.2007.72. PMID  17446890. S2CID  37361631.
  24. ^ Cerchione, Derek; Loveluck, Katherine; Tillotson, Eric L.; Harbinski, Fred; DaSilva, Jen; Kelley, Chase P.; Keston-Smith, Elise; Fernandez, Cecilia A.; Myer, Vic E.; Jayaram, Hariharan; Steinberg, Barrett E.; Xu, Shuang-yong (16 апреля 2020 г.). «Библиотеки SMOOT и направленная эволюция Cas9, вызванная фагом, для проектирования сниженной нецелевой активности». PLOS ONE . 15 (4): e0231716. Bibcode : 2020PLoSO..1531716C. doi : 10.1371 /journal.pone.0231716 . PMC 7161989. PMID  32298334. 
  25. ^ abcd Parker AS, Griswold KE, Bailey-Kellogg C (ноябрь 2011 г.). «Оптимизация комбинаторного мутагенеза». Журнал вычислительной биологии . 18 (11): 1743–56. Bibcode :2011LNCS.6577..321P. doi :10.1089/cmb.2011.0152. PMC 5220575 . PMID  21923411. 
  26. ^ Choi GC, Zhou P, Yuen CT, Chan BK, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong AS (август 2019 г.). «Массовый комбинаторный мутагенез оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Nature Methods . 16 (8): 722–730. doi :10.1038/s41592-019-0473-0. PMID  31308554. S2CID  196811756.
  27. ^ Uren AG, Kool J, Berns A, van Lohuizen M (ноябрь 2005 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез: прошлое, настоящее и будущее». Oncogene . 24 (52): 7656–72. doi :10.1038/sj.onc.1209043. PMID  16299527. S2CID  14441244.
  28. ^ abc Vassiliou G, Rad R, Bradley A (2010-01-01). "Использование ДНК-транспозонов для обнаружения генов рака у мышей". В Wassarman PM, Soriano PM (ред.). Руководство по методам развития мышей, часть B: молекулярная генетика мышей, 2-е издание . Методы в энзимологии. Том 477 (2-е изд.). Academic Press. стр. 91–106. doi :10.1016/s0076-6879(10)77006-3. ISBN 9780123848802. PMID  20699138.
  29. ^ «Метод гомологичной рекомбинации (и нокаутированная мышь)». Колледж Дэвидсона .
  30. ^ Дэмиен Био-Пеллетье; Винсент Дж. Дж. Мартин (2016). «Бесшовный сайт-направленный мутагенез генома Saccharomyces cerevisiae с использованием CRISPR-Cas9». Журнал биологической инженерии . 10 : 6. doi : 10.1186/s13036-016-0028-1 . PMC 4850645. PMID  27134651 . 
  31. ^ Xu S (20 августа 2015 г.). «Применение редактирования генома CRISPR-Cas9 у Caenorhabditis elegans». J Genet Genomics . 42 (8): 413–21. doi :10.1016/j.jgg.2015.06.005. PMC 4560834. PMID 26336798  . 
  32. ^ Худяков YE, Fields HA, ред. (25 сентября 2002 г.). Искусственная ДНК: методы и применение. CRC Press. стр. 13. ISBN 9781420040166.

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
мутагенезе
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках