stringtranslate.com

Нитрилаза

Ферменты нитрилазы ( нитриламиногидролаза ; EC 3.5.5.1) катализируют гидролиз нитрилов до карбоновых кислот и аммиака без образования «свободных» амидных промежуточных продуктов. [1] Нитрилазы участвуют в биосинтезе природных продуктов и посттрансляционных модификациях в растениях, животных, грибах и некоторых прокариотах. Нитрилазы также могут использоваться в качестве катализаторов в препаративной органической химии. Среди прочего, нитрилазы использовались для разделения рацемических смесей . Нитрилазу не следует путать с нитрилгидратазой (нитрилгидролиазой; EC 4.2.1.84), которая гидролизует нитрилы до амидов. Нитрилгидратазы почти всегда коэкспрессируются с амидазой, которая преобразует амид в карбоновую кислоту. Следовательно, иногда бывает трудно отличить активность нитрилазы от активности нитрилгидратазы и амидазы.

Механизм

Нитрилаза была впервые обнаружена в начале 1960-х годов благодаря своей способности катализировать гидратацию нитрила в карбоновую кислоту . [2] Хотя в то время было известно, что нитрилаза может работать с широкой субстратной специфичностью при производстве соответствующей кислоты, более поздние исследования сообщили о первой активности NHase ( нитрилгидратазы ), проявленной нитрилазой. [3] [4] То есть, амидные соединения также могут быть образованы посредством гидролиза нитрила . Дальнейшие исследования выявили несколько условий, способствующих образованию амида, которые описаны ниже. [4]

Превращение общего нитрила в амид или карбоновую кислоту осуществляется с помощью нитрилазы. [5] [1]

Ниже приведен список этапов, необходимых для преобразования общего нитрильного соединения с помощью нитрилазы: [4]

  1. Электрофильный углерод нитрила подвергается нуклеофильной атаке одной из двух SH-групп нитрилазы.
  2. Образовавшийся тиоимидат впоследствии гидролизуется до ацилензима, а в качестве побочного продукта образуется аммиак .
  3. Ацилензим может пройти один из двух путей в зависимости от условий, указанных выше:
    • Дальнейший гидролиз ацилензима водой приводит к образованию карбоновой кислоты и регенерированного фермента.
    • Ацилензим гидролизуется аммиаком, вытесняя фермент и образуя амидный продукт.

Структура

Активный сайт термоактивной нитрилазы из Pyrococcus abyssi, описывающий каталитическую триаду Lys-Cys-Glu, ответственную за расщепление связей CN. К сожалению, попытки кристаллизовать фермент с помощью фумаро- или малононитрила оказались неэффективными, поэтому мотив связывания остается неизвестным. [6]

Большинство нитрилаз состоят из одного полипептида в диапазоне от 32 до 45 кДа, [7] и его структура представляет собой ⍺-β-β-⍺ складку. [4] Предпочтительная форма фермента - большая нить, состоящая из 6-26 субъединиц . [7] Нитрилаза использует каталитическую триаду Lys - Cys - Glu , которая необходима для ее функции активного центра и повышения ее производительности. [4] [7]

Структура термоактивной нитрилазы из P. abyssi состоит из 2-кратного симметричного димера, в котором каждая субъединица содержит 262 остатка. [8] [9] Подобно другим нитрилазам в семействе нитрилаз, каждая субъединица имеет сэндвич-складку ⍺-β-β-⍺; когда две субъединицы объединяются и взаимодействуют, белок образует структуру «суперсэндвич» (⍺-β-β-⍺-⍺-β-β-⍺). [6] Для того чтобы димеризоваться, C-концы каждой субъединицы выходят из ядра и взаимодействуют друг с другом, и это в значительной степени становится возможным благодаря солевым мостикам, образованным между остатками аргинина и глутамата . [6]

Хотя точный механизм связывания с нитрильным субстратом до сих пор остается неизвестным, путем сравнения последовательности и структуры с другими нитрилазами было установлено, что каталитическая триада состоит из Glu 42, Lys 113 и Cys 146. [6] [4] [7] С помощью программ моделирования белков было обнаружено, что Glu 42 является каталитической основой при активации нуклеофила (Cys 146) на основе относительно короткого расстояния между O в Glu и S в Cys. Аналогичным образом, Lys 113 был выведен как каталитическая кислота, ответственная за перенос протона к субстрату. [8] [10]

Биологическая функция

Нитрилазы играют важную роль во взаимодействиях растений и микробов для защиты, детоксикации , использования азота и синтеза гормонов растений. [11] В растениях существуют две различимые группы в отношении субстратной специфичности: те, у которых высокая гидролитическая активность по отношению к арилацетонитрилам, и те, у которых высокая активность по отношению к β-циано- L -аланину . NIT1, 2 и 3 видов A. thaliana являются примерами первой группы растительных нитрилаз ( арилацетонитрилаз ), которые гидролизуют нитрилы, образующиеся во время синтеза или деградации цианогенных гликозидов и глюкозинолатов . Арилцетонитрильные субстраты для этих конкретных ферментов состоят из фенилпропионитрила и других продуктов, которые являются результатом метаболизма глюкозинолатов. [11] [12] Однако NIT4 принадлежит ко второй группе растительных нитрилаз и имеет решающее значение для детоксикации цианида в растениях. [3] [11] [13]

Более того, микробы также потенциально могут использовать нитрилазу для детоксикации и ассимиляции нитрилов и цианида, которые существуют в растительной среде. [11] Примером этого является β-циано- L -аланиннитрилаза растительной бактерии P. fluorescens SBW25. [14] Хотя неизвестно, сталкивается ли эта растительная бактерия с токсичными уровнями β-циано-ʟ-аланина в естественных условиях, активность нитрилазы наблюдалась в цианогенных растениях; таким образом, кажется, что нитрилаза служит в качестве преобладающего механизма для детоксикации цианида вместо β-циано-ʟ-аланина. [11] [14] Другие бактериальные применения нитрилаз, производимых ассоциированными с растениями микроорганизмами, включают деградацию растительных нитрилов для получения источника углерода и азота. P. fluorescens EBC191 гидролизует многие арилацетонитрилы, а именно нитрил миндальной кислоты , который служит защитой от травоядных животных. [11] [15] [16]

Дальнейшее чтение

Ссылки

  1. ^ ab Pace HC, Brenner C (2001). "Суперсемейство нитрилаз: классификация, структура и функция". Genome Biology . 2 (1): REVIEWS0001. doi : 10.1186 /gb-2001-2-1-reviews0001 . PMC 150437. PMID  11380987. 
  2. ^ Thimann KV, Mahadevan S (апрель 1964). "Нитрилаза. I. Возникновение, получение и общие свойства фермента". Архив биохимии и биофизики . 105 : 133–41. doi :10.1016/0003-9861(64)90244-9. PMID  14165487.
  3. ^ ab Piotrowski M, Schönfelder S, Weiler EW (январь 2001 г.). «Изоген NIT4 Arabidopsis thaliana и его ортологи в табаке кодируют бета-циано-L-аланингидратазу/нитрилазу». Журнал биологической химии . 276 (4): 2616–21. doi : 10.1074/jbc.M007890200 . PMID  11060302.
  4. ^ abcdef Gong JS, Lu ZM, Li H, Shi JS, Zhou ZM, Xu ZH (октябрь 2012 г.). "Нитрилазы в биокатализе нитрила: недавний прогресс и предстоящие исследования". Microbial Cell Factorys . 11 : 142. doi : 10.1186/1475-2859-11-142 . PMC 3537687. PMID  23106943 . 
  5. ^ Heinemann U, Engels D, Bürger S, Kiziak C, Mattes R, Stolz A (2003). «Клонирование гена нитрилазы из штамма цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 и гетерологичная экспрессия и характеристика кодируемого белка». Applied and Environmental Microbiology . 69 (8): 4359–66. Bibcode :2003ApEnM..69.4359H. doi :10.1128/AEM.69.8.4359-4366.2003. PMC 169084 . PMID  12902216. 
  6. ^ abcd Raczynska JE, Vorgias CE, Antranikian G, Rypniewski W (февраль 2011 г.). «Кристаллографический анализ термоактивной нитрилазы». Журнал структурной биологии . 173 (2): 294–302. doi :10.1016/j.jsb.2010.11.017. PMID  21095228.
  7. ^ abcd O'Reilly C, Turner PD (2003). "Семейство нитрилаз CN-гидролизующих ферментов - сравнительное исследование". Журнал прикладной микробиологии . 95 (6): 1161–74. doi :10.1046/j.1365-2672.2003.02123.x. PMID  14632988. S2CID  8278739.
  8. ^ аб Накаи Т, Хасегава Т, Ямасита Э, Ямамото М, Кумасака Т, Уэки Т, Нанба Х, Икенака Ю, Такахаши С, Сато М, Цукихара Т (июль 2000 г.). «Кристаллическая структура амидогидролазы N-карбамил-D-аминокислот с новым каталитическим каркасом, общим для амидогидролаз». Структура . 8 (7): 729–37. дои : 10.1016/s0969-2126(00)00160-x . ПМИД  10903946.
  9. ^ Pace HC, Hodawadekar SC, Draganescu A, Huang J, Bieganowski P, Pekarsky Y, Croce CM, Brenner C (2017-07-27). «Кристаллическая структура белка NitFhit Rosetta Stone червя выявляет тетрамер Nit, связывающий два димера Fhit». Current Biology . 10 (15): 907–17. doi : 10.1016/s0960-9822(00)00621-7 . PMID  10959838. S2CID  4644034.
  10. ^ Yeates TO (1997-01-01). "Обнаружение и преодоление двойникования кристаллов". Macromolecular Crystallography Part A. Methods in Enzymology. Vol. 276. pp. 344–58. doi :10.1016/s0076-6879(97)76068-3. ISBN 978-0-12-182177-7. PMID  9048378.
  11. ^ abcdef Howden AJ, Preston GM (июль 2009). «Ферменты нитрилазы и их роль во взаимодействиях растений и микробов». Microbial Biotechnology . 2 (4): 441–51. doi :10.1111/j.1751-7915.2009.00111.x. PMC 3815905 . PMID  21255276. 
  12. ^ Vorwerk S, Biernacki S, Hillebrand H, Janzik I, Müller A, Weiler EW, Piotrowski M (март 2001 г.). «Ферментативная характеристика подсемейства рекомбинантных нитрилаз Arabidopsis thaliana, кодируемых кластером генов NIT2/NIT1/NIT3». Planta . 212 (4): 508–16. Bibcode :2001Plant.212..508V. doi :10.1007/s004250000420. PMID  11525507. S2CID  25573914.
  13. ^ Piotrowski M (ноябрь 2008 г.). «Первичный или вторичный? Универсальные нитрилазы в метаболизме растений». Фитохимия . 69 (15): 2655–67. Bibcode : 2008PChem..69.2655P. doi : 10.1016/j.phytochem.2008.08.020. PMID  18842274.
  14. ^ ab Howden AJ, Harrison CJ, Preston GM (январь 2009 г.). «Сохраняющийся механизм метаболизма нитрила у бактерий и растений». The Plant Journal . 57 (2): 243–53. doi : 10.1111/j.1365-313X.2008.03682.x . PMID  18786181.
  15. ^ Kiziak C, Conradt D, Stolz A, Mattes R, Klein J (ноябрь 2005 г.). «Нитрилаза из Pseudomonas fluorescens EBC191: клонирование и гетерологичная экспрессия гена и биохимическая характеристика рекомбинантного фермента». Microbiology . 151 (Pt 11): 3639–48. doi : 10.1099/mic.0.28246-0 . PMID  16272385.
  16. ^ Legras JL, Chuzel G, Arnaud A, Galzy P (июнь 1990 г.). «Природные нитрилы и их метаболизм». World Journal of Microbiology & Biotechnology . 6 (2): 83–108. doi :10.1007/BF01200927. PMID  24429979. S2CID  5463965.

Внешние ссылки