stringtranslate.com

Северо-западный блот

Северо -западный блоттинг , также известный как северо-западный анализ , представляет собой гибридный аналитический метод вестерн -блоттинга и нозерн-блоттинга и используется в молекулярной биологии для обнаружения взаимодействий между РНК и белками . Родственный метод, вестерн-блоттинг, используется для обнаружения интересующего белка, который включает перенос белков, разделенных с помощью гель-электрофореза , на нитроцеллюлозную мембрану. Окрашенный осадок скапливается вдоль полосы на мембране, содержащей определенный целевой белок. Нозерн-блоттинг — это аналогичный аналитический метод, который вместо обнаружения интересующего белка используется для изучения экспрессии генов путем обнаружения РНК (или изолированной мРНК) на аналогичной мембране. Северо-западный блот сочетает в себе два метода и, в частности, включает идентификацию меченой РНК, которая взаимодействует с белками, иммобилизованными на аналогичной нитроцеллюлозной мембране.

История

Эдвин Саузерн первым создал Саузерн-блоттинг , [1] аналитический метод, используемый для обнаружения ДНК. Этот метод предполагает использование гель-электрофореза , важного аналитического метода, который включает использование электрического поля и последующую миграцию заряженной ДНК, РНК или белков через это электрическое поле в зависимости от размера и заряда. [2] С помощью Саузерн-блоттинга отделенные фрагменты ДНК затем переносятся на мембранный фильтр для обнаружения. [1] Обнаружение происходит, когда полосы становятся видимыми на мембране и коррелируют с конкретной интересующей молекулой. [2] Впоследствии были созданы другие подобные методы блоттинга с аналогичной номенклатурой для обнаружения различных молекул или взаимодействий между молекулами. Эти методы включают вестерн-блоттинг (обнаружение белка), нозерн-блоттинг (обнаружение РНК), юго-западный блот (обнаружение взаимодействия ДНК-белок), восточный блоттинг (обнаружение посттрансляционных модификаций) и северо-западный блоттинг (обнаружение взаимодействия РНК-белок). . [3] [4] [5] [6]

Особенности техники

Проведение северо-западного блоттинга включает разделение РНК- связывающих белков с помощью гель-электрофореза , который позволит разделить РНК-связывающие белки в зависимости от их размера и заряда. Отдельные образцы можно загрузить в агарозный или полиакриламидный гель (обычно SDS-PAGE), чтобы анализировать несколько образцов одновременно. [5] После завершения гель-электрофореза гель и связанные с ним РНК-связывающие белки переносят на нитроцеллюлозную бумагу для переноса. [7]

Затем вновь перенесенные блоты пропитывают блокирующим раствором; обезжиренное молоко и альбумин бычьей сыворотки являются распространенными блокирующими буферами. [8] Этот блокирующий раствор помогает предотвратить неспецифическое связывание первичных и/или вторичных антител с нитроцеллюлозной мембраной. Как только блокирующий раствор имеет достаточное время контакта с блотом, наносится конкретная конкурентная РНК и дается время для инкубации при комнатной температуре. За это время конкурентная РНК связывается с РНК-связывающими белками в образцах, находящихся на блоте. Время инкубации во время этого процесса может варьироваться в зависимости от концентрации нанесенной конкурентной РНК; хотя время инкубации обычно составляет один час. [9] После завершения инкубации блот обычно промывают не менее 3 раз по 5 минут каждый раз, чтобы разбавить РНК в растворе. Обычные промывочные буферы включают физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) или 10% раствор Tween 20 . [10] Неправильная или неадекватная промывка повлияет на четкость развития блота. После завершения промывки блот обычно проявляют с помощью рентгеновских лучей или аналогичных авторадиографических методов. [11]

Приложения

После проведения блота с помощью рентгенографии или авторадиографии результаты можно проанализировать и интерпретировать для определения приблизительного размера и концентрации интересующего(их) РНК-связывающего белка(ов) для дальнейшего изучения белка(ов). Расположение и концентрация РНК-связывающего белка на блоте могут повлиять на результаты, и иногда после проявления могут появляться полосы. Эти полосы могут помочь исследователям определить размер и концентрацию интересующего РНК-связывающего белка. [12] Когда известен приблизительный размер белка, исходный образец можно подвергнуть хроматографии , чтобы разделить его по размеру. [13] Кроме того, как только белок выделен, его можно переварить трипсином, а масс-спектрометрию можно использовать для секвенирования пептидов с целью определения идентичности конкретного белка. [14]

Преимущества и недостатки

Преимущества северо-вестерн-блоттинга включают ускоренное обнаружение специфических белков, связывающих РНК, а также оценку приблизительной молекулярной массы этих белков. [15] Северо-западный блоттинг позволяет недорого обнаружить идентифицированные белки. Блоттинг обычно является первым шагом в исследовании, поскольку он позволяет определить приблизительную молекулярную массу. Как только молекулярная масса известна, это позволяет провести дальнейшее исследование или очистку с помощью других методов, таких как хроматография. Еще одним преимуществом северо-западного блоттинга является то, что он помогает создавать библиотеки экспрессии родственных лигандов. [16]

Отмеченным недостатком является то, что некоторые взаимодействия РНК-белок с плохими свойствами связывания РНК могут быть не так заметны с помощью этого метода. [15] Также процедура блоттинга может занять от 3 до 5 часов. Если процедура выполнена неправильно, это может привести к значительному фону, который может привести к нечеткому блоту идентифицированных белков. Кроме того, белки должны ренатурировать после разделения и переноса на нитроцеллюлозную мембрану. Последний недостаток заключается в том, что белки должны состоять из одного полипептида или двух субъединиц, которые мигрируют в матрице геля. [17]

Смотрите также

Протоколы

Северо-западный блот взаимодействия белка и РНК из метелок молодого риса

Выделение РНК и нозерн-блот-анализ

Белковый блоттинг

Рекомендации

  1. ↑ Ab Southern, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Обнаружение специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных с помощью гель-электрофореза». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. дои : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN  0022-2836. PMID  1195397. S2CID  20126741.
  2. ^ Аб Нельсон, Кокс (2013). Ленингерские принципы биохимии . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: WH Freeman and Company. п. 179. ИСБН 978-1-4641-0962-1.
  3. ^ Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж. Рафф М., Робертс К., Уолтер П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francisco Group, Нью-Йорк, стр. 538–539.
  4. ^ Кевил, К.Г., Уолш, Л., Лару, Ф.С., Калогерис, Т., Гришам, М.Б., Александр, Дж.С. (1997) Улучшенный быстрый северный протокол. Биохим. и биофиз. Исследовательский комм. 238:277-279.
  5. ^ аб Рэпли, Р. (2000). Справочник протоколов нуклеиновых кислот. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press Inc., с. 783. ИСБН 978-0-89603-459-4.
  6. ^ Николас; Нельсон (2013). «Север, Юг или Восток? Методы блоттинга». Журнал исследовательской дерматологии . 133 (е10): е10. дои : 10.1038/jid.2013.216 . ПМИД  23760052.
  7. ^ Верена, Бичсел; Альфред Вальц; Матиас Бикель (1997). «Идентификация белков, специфически связывающихся с 3'-нетранслируемой областью мРНК фактора, стимулирующего гранулоциты / макрофаги». Исследования нуклеиновых кислот . 25 (12): 2417–2423. дои : 10.1093/нар/25.12.2417. ПМК 146745 . ПМИД  9171094. 
  8. ^ Ляо, Хьюи-Джейн; Рюдзи Кобьяши и Майкл Б. Мэтьюз; Мэтьюз, МБ (21 июля 1998 г.). «Активность РНК, связанных с аденовирусным вирусом: очистка и характеристика РНК-связывающих белков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (15): 8514–9. Бибкод : 1998PNAS...95.8514L. дои : 10.1073/pnas.95.15.8514 . ПМК 21107 . ПМИД  9671709. 
  9. ^ С, Франке; Графе Д; Барч Х; Бахманн М (2009). Использование нерадиоактивного метода обнаружения для северного и юго-западного блоттинга . Методы молекулярной биологии. Том. 536. стр. 441–9. дои : 10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN 978-1-934115-73-2. ПМИД  19378081.
  10. ^ Шумахер, Джилл; Кисук Ли; Сюзанна Эдельхофф; Роберт Браун (май 1995 г.). «Spnr, мышиный РНК-связывающий белок, локализованный в цитоплазматических микротрубочках». Журнал клеточной биологии . 129 (4): 1023–1032. дои : 10.1083/jcb.129.4.1023. ПМК 2120489 . ПМИД  7744952. 
  11. ^ Столман, SA; Р.С. Барик; Г. Н. Нельсон; Л. Х. Со; Л. М. Велтер; Р. Дж. Динс (1988). «Специфическое взаимодействие между лидерной РНК коронавируса и белком нуклеокапсида». Журнал вирусологии . 11. 62 (11): 4288–95. дои : 10.1128/JVI.62.11.4288-4295.1988. ПМК 253863 . ПМИД  2845141. 
  12. ↑ Тангасами, Саминатан (5 апреля 2013 г.). «Северо-западный блоттинг взаимодействия белка и РНК из молодых рисовых метелок». Био-протокол . 3 (7): е625. дои : 10.21769/BioProtoc.625 . Проверено 26 марта 2014 г.
  13. ↑ Пердью, Гэри (17 августа 2008 г.). Регуляция экспрессии генов: молекулярные механизмы. Спрингер. п. 129. ИСБН 9781597452281.
  14. ^ Гэри Х. Пердью; Джек П. Ванден Хьювел; Джеффри М. Питерс (2008). Регуляция экспрессии генов: молекулярные механизмы . Спрингер. п. 129. ИСБН 9781597452281.
  15. ^ Аб Смит, Кристофер WJ (1998). Взаимодействия РНК-белок: Практический подход: Практический подход . Издательство Оксфордского университета. п. 187. ИСБН 9780191591624.
  16. ↑ Уолдо, Коэн (16 августа 1991 г.). Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии. Академическая пресса. п. 186. ИСБН 9780080863290.
  17. ^ Николсон, Аллен В. (2001). Рибонуклеазы, Часть A: Функциональные роли и механизмы действия: Функциональные роли и механизмы действия. Академическая пресса. п. 409. ИСБН 9780080496917.